乳酸菌对干酪风味形成作用的研究进展

司阔林，闫清泉，李玲玉，任敏，赵中华，宗学醒

内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司（呼和浩特 011500）

干酪（cheese）是一种营养丰富的发酵乳制品，世界上有上千种干酪，每种干酪都具有本身所独有的风味和质构。干酪风味的形成是一个动态且复杂的生物化学过程（图1）[1]，干酪风味物质主要为微生物群对乳脂、蛋白质和碳水化合物的综合代谢并伴随着干酪基质中酶的进一步生物化学转化而产生的挥发性风味物质和芳香性风味物质等混合物，其中乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在成熟干酪微生物群中占主导地位。因此，通过高效利用乳酸菌，能够促进干酪成熟，改善或者开发新风味。本文将重点综述干酪在成熟过程中如何通过一系列生化反应获得独特风味及乳酸菌在其中作用两个方面。

图1 干酪风味形成的动态过程

1 干酪风味物质形成的关键代谢途径

风味是任何发酵乳制品最重要的属性之一。消费者愿意尝试不同口味的乳制品，因此，许多发酵乳制品公司都将发酵剂作为使产品风味多样化的工具。如图2所示，干酪风味形成是一个复杂的过程，需要微生物、生物化学和技术等方面的组合，其中乳酸菌主要的代谢途径为糖（乳糖）酵解、柠檬酸代谢、蛋白质水解和随后的氨基酸分解代谢，游离脂肪酸的释放（脂解）及其代谢也参与其中，但分解程度较轻[2]。例如在切达干酪的特征香气中，一半强烈风味来自于乳糖发酵和柠檬酸盐代谢（少数来于脂肪降解），另外一半源于亮氨酸和蛋氨酸的分解，其中甲硫氨酸和甲硫醇就是蛋氨酸产生的主要芳香化合物，分别有助于切达干酪的香气和令人愉悦的大蒜风味[3]。表1列出了4种常见干酪的关键风味化合物[4]。

图2 发酵乳制品风味形成的主要代谢途径

1.1 蛋白质降解

酪蛋白降解无疑是硬质和半硬质干酪形成风味物质最重要的生化反应。蛋白质降解合成风味物质途径如图3所示[5]。在干酪成熟过程中，蛋白质降解产生风味物质的第一步是酪蛋白被乳酸菌细胞壁蛋白酶水解成小肽和氨基酸，其中乳酸乳球菌PrtP是目前最具特色的乳酸菌蛋白酶，且具有相当广泛的特异性，能够将酪蛋白分解为100多种不同的寡肽[6]，寡肽被寡肽转运系统（OPP系统）和二/三肽转运蛋白通过细胞膜摄入细胞内[图3（A～D）]，肽在细胞内被各种肽酶降解为氨基酸。值得一提的是，尽管肽和氨基酸具有特殊的风味特征，如甜味、苦味和麦芽味等，但通常认为它们仅能增加干酪的基本口味，例如刺激或过度表达几种蛋白水解酶或向干酪中添加氨基酸仅观察到轻微的风味差异[7]。尽管如此，蛋白质在降解过度及水解不利的情况下会产生过多的苦味肽，超过感官阈值后会严重影响干酪的风味[8]。总而言之，尽管蛋白质水解和肽水解对干酪风味形成很重要，但是却不是蛋白质转化风味物质过程的关键控制点。

如表1所示，3-甲基丁醛、异戊酸和苯甲醛等都是干酪关键风味化合物，而这些风味物质都是氨基酸在细胞内被氨基酸转氨酶[图3（1）]转化为α-酮酸再进一步反应而成，目前在乳酸菌中还未发现其他类型的脱氨酶，氨基酸转氨酶途径是氨基酸分解代谢的第一步，同时也是干酪风味形成至关重要的一步。有研究在敲除芳香族氨基酸转氨酶基因后发现半硬质干酪中缺乏苯丙氨酸衍生的风味化合物，再一次证明转氨作用对形成苯丙氨酸衍生的风味物质是必不可少的[9]。氨基酸另外一个重要因素，干酪风味形成过程中最感兴趣的代谢途径由裂解酶[图3（10）]启动，如在大多数乳酸菌中存在的胱硫醚b-裂解酶和半胱氨酸-硫辛酸g-裂解酶，能将蛋氨酸转化为甲硫醇，另一类裂解酶苏氨酸醛缩酶[图3（9）]能将苏氨酸直接转化为乙醛[10]。氨基酸的第三种转化途径是脱氨基/脱羧成生物胺[11]，关于生物胺的健康风险及干酪不同成熟期生物胺量及与细菌菌落结构之间的关系已经进行了研究[12-13]，氨基酸的直接脱羧解释了大多数胺的存在，但还不能解释仲胺和叔胺的形成。

表1 四种常见干酪的关键及其他重要风味物质

干酪风味形成的关键中间体α-酮酸，可以进一步被氢化为羟酸[图3（2）]、被脱羧为醛[图3（3）]和被脱氢酶复合物脱氢/氧化脱羧为乙酰辅酶A衍生物[图3（8）]，乙酰辅酶A衍生物还可以进一步转化为风味化合物异戊酸。这些反应大多是酶促的，但是也发现一些化学转化途径，例如由苯丙酮酸生成苯甲醛的转化过程[14]。α-酮酸被氢化而成羧酸，在一些发酵乳制品中已经发现来自支链氨基酸、阿拉伯氨基酸和蛋氨酸的羟酸，它们既不是主要的风味化合物，也不是风味化合物的前体，反而会导致α-酮酸浓度降低，从而对风味化合物含量（如醛）产生负面影响。醛通常可以脱氢[图3（4）]或氢化[图3（5）]为相应的醇或羧酸，而这些产物也是酯酶和酰基转移酶的底物[图3（7）]，从而生成（硫代）酯。酯类物质（如丁酸乙酯）有助于切达干酪和高达干酪的风味，但含量过高可能会导致切达干酪水果味缺陷。在卡门培尔干酪中，苯丙氨酸降解产生的苯乙醛、2-苯乙醇和乙酸苯乙酯均带有玫瑰般花香的成分，从而使干酪产生令人愉悦的花香[4]。除氨基酸代谢外，糖和脂肪代谢也为酯的生成提供了底物。

支链醛被醛脱氢酶氧化后会生成相应的支链有机酸[图3（5）]，而支链有机酸通常被认为是形成（较长）支链脂肪酸的底物，最有可能存在于乳酸菌中的一种酮酸脱氢酶复合物[图3（8）]，也能够将α-酮酸直接转化为相应的羧酸，如异戊酸。此外，这些羧酸还是其他芳香化合物如酯、硫代酯、甲酚和3-甲基吲哚的前体。大多数乳酸菌中都鉴定出了醇脱氢酶[图3（4）][15]，醛的风味强度高于其相应醇的风味强度（表1），因此，当干酪需要最大风味强度时，这种向醇的转化可能不利。

图3 与干酪风味物质形成相关的蛋白质转化途径

1.2 脂肪降解

脂肪降解对干酪的风味和质构也有重要影响。干酪中的脂肪可以提供脂肪-水-蛋白质的接触面，使香气形成的反应发生，同时作为溶剂溶解脂溶性香气化合物，在干酪食用过程时再释放出来[16]。

脂肪的分解代谢途径如图4所示。脂肪分解是由脂肪酶（原生乳脂酶、外源添加的哺乳动物胃前脂酶或微生物脂酶）引起的[17]。干酪脂肪中98%是甘油三酯，甘油三酯被分解后释放出甘油和游离脂肪酸。长链脂肪酸（碳链中碳原子数大于12）因为感官阈值较高，在干酪风味中起很小的作用，而短链、中链脂肪酸及偶数脂肪酸（碳链中碳原子数4～12）的感官阈值较低[16]，并且每一种脂肪酸都赋予干酪一种特殊的风味，例如丁酸有助于腐败味和干酪味的形成，己酸有一种辛辣味，是蓝纹干酪的风味特征[18]。但是其中的多不饱和脂肪酸容易被氧化产生多种醛类化合物，这些醛类物质风味比较刺激，浓度过高易造成酸败等不愉悦的风味缺陷，因此要合理控制脂肪分解的程度。而且游离脂肪酸必须与其他风味化合物达到平衡状态才能产生香气。相比于游离脂肪酸，大多数衍生自游离脂肪酸（碳链中碳原子数为10）的风味活性酯的风味感知阈值要低得多，只是赋予干酪一些水果味。游离脂肪酸同时也是产生一些风味和芳香化合物的分解反应的前体，例如被氧化和脱羧生成甲基酮和仲醇、羟基脂肪酸的酯化生成内酯、与醇基反应形成酯，如丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和己酸甲酯等。

图4 与干酪风味物质形成相关的脂肪转化途径

不同类型的干酪脂肪酸种类、含量不同，所产生的风味也有着较大差异。例如在罗马诺干酪、帕玛森干酪和波萝伏洛干酪这三种意大利品种中，罗马洛干酪游离脂肪酸是最高的，波萝伏洛干酪处于中间水平，帕玛森是最低的[19]。还有研究表明，丁酸是罗马洛干酪和波罗夫洛干酪中很重要的风味化合物，它也是衡量这两种干酪风味强度和风味特征的最重要的指标之一[20]。Atasoy等[21]研究表明，风味最好的切达干酪含有4.5～5.0 mg/kg丁酸和2.0～2.5 mg/kg己酸，许多研究已经表明低脂切达干酪缺乏典型风味并且有较低浓度的游离脂肪酸，这证明了游离脂肪酸对切达干酪风味有很重要的作用[22]。

1.3 柠檬酸分解和糖酵解

芳香化合物的形成与柠檬酸盐和乳糖的代谢也有关，代谢途径如图5所示。柠檬酸是牛乳中的微量成分，能被乳酸乳球菌代谢产生乙酰乳酸、二乙酰和3-羟基丁酮。丁二酮乳酸菌和明串珠菌也可将其分解成CO2和丁二酮等碳基化合物，这些化合物都是组成干酪风味的必要成分[23]。然而值得注意的是，嗜热乳酸菌通常是柠檬酸盐阴性菌。

图5 与干酪风味物质形成相关的柠檬酸和乳糖转化途径

干酪绝大部分乳糖随乳清排出，剩余乳糖经乳酸菌代谢生成乳酸，可形成强烈的乳酸风味。这种乳酸有抑菌作用，可以改变干酪的pH，降低干酪中氧化还原电位，为酶促反应的进行提供有利条件[24]。乳糖作为风味物质来源，先被发酵剂细菌（乳酸菌）水解成葡萄糖和半乳糖（发酵剂为乳球菌时为6-磷酸-己酮糖），然后葡萄糖通过糖酵解（EMP）途径氧化为丙酮酸。丙酮酸是形成短链风味化合物的前体，如乙酸、二乙酸、丁酸、丙酸、乙醇、乙醛和3-羟基-丁酮。半乳糖则被半乳糖阳性发酵剂和明串珠菌通过半乳糖降解途径生成6-磷酸-己酮糖，而乳球菌通过另外一种途径将半乳糖降解为甘油醛3-磷酸-甘油醛[25]。乳糖和乳酸的代谢在大部分的干酪中属于基本代谢类型。乳酸异构化作用对干酪风味的影响较小，但乳糖在丙酸菌的作用下会生成丙酸和乙酸，较大程度上影响干酪的整体风味。另外在干酪成熟期间，乳酸会继续转化为丙酮，赋予干酪水果味和不愉悦的风味[24]。乳酸也是干酪中许多微生物生长的重要底物，其进一步代谢也是影响干酪风味的主要因素。

2 乳酸菌在干酪风味物质形成过程中的作用

乳酸菌是一种革兰氏阳性菌，由于其重要的生理功能和生化作用，已被广泛用于发酵食品尤其是发酵乳制品的生产中。干酪在成熟过程中的微生物群主要由乳酸菌为主，根据其作用可分为两大类：发酵剂乳酸菌（starer lactic acid bacteria，SLAB，如切达干酪的嗜温乳球菌）和非发酵剂乳酸菌（non-starer lactic acid bacteria，NSLAB，如乳杆菌），如图6所示。发酵剂乳酸菌和非发酵剂乳酸菌相互作用主导着干酪风味物质生成的代谢途径[26]。因此，将分别对不同种类的乳酸菌在干酪风味物质形成过程中的作用进行综述。

图6 在制作干酪和成熟过程中发酵剂乳酸菌和非发酵剂乳酸菌的相互作用导致风味形成的生化途径

2.1 发酵剂乳酸菌在干酪风味物质形成过程中的作用

干酪发酵剂也可根据其作用被分为两组：主发酵剂和附属发酵剂。主发酵剂是指能够代谢原料乳中的乳糖生成乳酸或乳酸盐的发酵剂，主要目的以酸化为主，由嗜温型或嗜热型的乳酸菌组成。例如制作荷兰艾达姆干酪和高达干酪的发酵剂主要由同型乳酸发酵的乳酸乳球菌以及能够进行柠檬酸代谢的乳酸乳球菌和明串珠菌构成[27]。附属发酵剂为选定的干酪相关微生物菌株，将其添加到干酪牛乳中能够改善干酪感官品质，促进并协调干酪风味物质及色素的形成。总而言之，干酪发酵剂乳酸菌主要的菌种有乳酸球菌属、嗜热链球菌属、明串珠菌属、片球菌属、肠球菌属的种、亚种及变种等；另外，某些特殊的干酪为了能形成特有的组织状态还需要添加丙酸菌。

如图6所示，发酵剂乳酸菌先利用乳糖作为碳源生成乳酸，柠檬酸是一些乳酸菌的次要能源，已知三种类型的乳制品发酵剂能够吸收柠檬酸并将其代谢为额外的风味化合物：乳酸乳杆菌、双乙酰乳酸乳球菌和明串珠菌属[28]。柠檬酸和乳糖的共同代谢会产生CO2和C4芳香化合物，例如二乙酰（黄油味）[28]。不同种类的发酵剂乳酸菌在干酪中酪蛋白代谢途径也有很大作用。刘瑛等[29]用甘肃天祝新鲜牦牛乳为原料分别添加嗜温、嗜热和混合发酵剂制作硬质干酪，结果表明对蛋白降解程度越大的发酵剂制作的干酪越容易产生苦味，其中，嗜热发酵剂对干酪蛋白降解程度最大，混合发酵剂次之，嗜温发酵剂最小。

支链酮酸的脱羧作用[图3（3）]会产生具有麦芽糖味、巧克力味及极低气味阈值的醛类物质，尤其3-甲基丁醛是许多硬质和半硬质干酪的关键风味化合物，这是由于亮氨酸能够被干酪微生物群有效分解。然而一般认为，只有乳球菌、乳杆菌、链球菌、食肉杆菌和肠球菌等乳酸菌涉及干酪中3-甲基丁醛的形成[30]。目前已有研究表明乳酸菌中可能有两种分解代谢亮氨酸生成3-甲基丁醛的途径[30]：一是通过α-酮酸脱羧酶（KADC）直接使α-酮酸脱羧而生成，例如德氏乳杆菌亚种（L.delbrueckiisubsp. lactis）CNRZ 207；另外一种是通过α-酮酸脱氢酶（KADH）的间接途径，例如瑞士乳杆菌（L.helveticus）CNRZ 32和粪肠球菌（E.faecalis）10C1。在马尔他芳香卡诺杆菌中，两种代谢途径都存在并且起作用。同时由于3-甲基丁醛在特定干酪风味中的重要性，已经提出了许多策略来控制其生产。

有些研究已经将特定的发酵剂添加到干酪中以控制独特风味的形成。Eugster等[31]在干酪添加乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）FAM18098成熟发酵后发现，该菌株将精氨酸转化为鸟氨酸、分解代谢丝氨酸和苏氨酸生成α-氨基丁酸和丙氨酸，乙酸盐含量也高于不添加该菌株的干酪对照组，显著影响干酪成熟和风味质构。此外，Hickey等[32]为了评估发酵剂乳酸菌对切达干酪脂肪水解的作用，将添加和不添加发酵剂的牛奶发酵成熟进行实验对比，结果表明添加发酵剂的干酪能主动产生游离脂肪酸且含量明显高于无发酵剂的干酪，这表明发酵剂乳酸菌酯酶是干酪中脂肪分解的主要因素。此外，乳酸菌酯酶不仅能催化乳脂甘油酯的水解以释放游离脂肪酸，还会通过转移酶反应将甘油酯和醇合成酯。总而言之，乳酸菌的酯酶影响干酪的脂肪分解和酯风味，且对干酪风味的影响可以通过控制酯酶的量、调节醇的利用率和增加乳脂的甘油单酯和甘油二酯含量来控制。

2.2 非发酵剂乳酸菌在干酪风味物质形成过程中的作用

与发酵剂乳酸菌相比，干酪中的非发酵剂乳酸菌源于原料乳和加工环境[33]。非发酵剂乳酸菌属于外来细菌且产酸能力较弱，但有研究表明，干酪中某些固有的独特风味可能是天然微生物群而不是发酵剂乳酸菌的产物，而且尽管非发酵剂乳酸菌在凝乳后的浓度可能较低（102～103CFU/g），但在成熟3～9个月后，其种群数量会缓慢增加约4～6个数量级[34]。如图6所示，尤其是在硬质和半硬质干酪（例如切达干酪和埃门塔尔干酪）中，非发酵剂乳酸菌在干酪成熟期的大部分时间主导着微生物群。切达干酪微生物群中占优势的非发酵剂乳酸菌主要由嗜温兼性异发酵乳酸杆菌（L.casei，L.paracasei，L.rhamnosus，L.plantarum和L.curvatus）组成。Gobbetti等[34]研究表明在切达干酪中，由于非发酵剂乳酸菌的存在，蛋白水解水平显著增加，风味强度也显著增强。越来越多的研究从高质量发酵乳中筛选出性能优良的非发酵剂乳杆菌株，再添加到干酪中来加强干酪风味的产生，例如陈洋[35]将筛选的非发酵剂瑞士乳杆菌（L.helveticus）SMN2-1再添加到切达干酪的生产过程中，结果表明添加非发酵剂后的切达干酪在成熟过程中风味变化明显，但是趋势相同。然而，非发酵剂乳酸菌对干酪风味的作用至今仍存在争议，一些菌株似乎能生产出高质量的切达干酪，而另一些菌株则会使干酪过酸和产生苦味，O’Sullivan等[36]研究发现，在最初的成熟阶段，由于发酵剂乳酸菌的缺乏，过量的碳水化合物（乳糖和半乳糖）和柠檬酸盐的存在可能会提供非发酵剂干酪乳酸菌过多的基质，导致瑞士类型干酪中产生过量的CO2和孔眼形成缺陷。

3 结语

干酪由于其丰富的营养价值和独特的风味，越来越受到消费者的青睐。风味是食品感官机能的最重要指标，干酪风味的形成是一个复杂的动态生化过程，而干酪基质中存在的乳酸菌在此过程中起着关键作用。因此，详细综述了干酪风味形成的代谢途径，在此基础上讨论乳酸菌在各个代谢途径相互作用的机制，以期有助于在干酪生产过程中通过选择特定菌种，赋予产品一致性的风味质构，尤其是需要长时间成熟的干酪，能够增强其特定的风味甚至开发新风味。