大果山楂-甘蔗复合果酒澄清剂的筛选与优化

何思莲，钟玉莲，李品卫，曾吕生，庞国萍，陈渊*

1. 广西农产资源化学与生物技术重点实验室，玉林师范学院化学与食品科学学院（玉林 537000）；2. 广州华糖食品有限公司（广州 510760）；3. 广西贵港市甘化集团有限公司（贵港 537100）

大果山楂属于南山楂的一种，是广西传统果品之一，具有悠久的种植历史。大果山楂具有较高的医用价值，能增加冠状动脉血量、加强和调节心肌、降低血压[1]，已被中华人民共和国国家卫生健康委员会确定为药食两用的食品。甘蔗是高产廉价的糖料农作物，含有丰富的维生素、矿物质等元素和抗氧化活性成分[2]，是酿造果酒的良好原料。将二者混合发酵酿造得到复合果酒，使其营养成分和保健功能互补，口感更为全面。但完成发酵的复合果酒在贮藏时，酒体中的果胶质、蛋白质、色素、单宁等大分子成分易发生凝集沉淀，降低果酒品质。通过单因素试验筛选高效的澄清剂，采用响应面进行复合澄清剂复配比例的优化，进一步确定最佳澄清工艺条件，为经济有效地澄清大果山楂-甘蔗复合果酒、提高酒体品质和贮藏稳定性提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

大果山楂（购于玉林宏进批发市场）；甘蔗汁（初压汁，采自广西某糖厂）。

葡萄酒活性干酵母BV818、无水柠檬酸、白砂糖、皂土、壳聚糖、PVPP、明胶、硅藻土等（均为食品级）。

DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SHZ-82型水浴恒温振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）；JJ500型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；JYZ-V902型九阳榨汁机（九阳股份有限公司）；TDZ5-WS型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UV-1600型紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；HH-S4型数显恒温水浴锅（江苏金仪仪器科技有限公司）；ST3100型pH计（奥豪斯仪器常州有限公司）。

1.2 果酒制备工艺流程

发酵所得果酒，用不同澄清剂在25 ℃进行澄清处理24 h后，于紫外分光光度计500 nm检测其透光率。

1) 原料处理：挑选新鲜的大果山楂清洗干净，除去果蒂和果梗，榨汁，过滤除渣后冷冻备用（固形物含量14.5 °B）；甘蔗初压汁（糖度17.7%）经4层纱布过滤3次，冷冻备用。

2) 混合：大果山楂汁与甘蔗汁按1∶2（V/V）比例进行混合，混合液在室温下静置1 h后，在4 000 r/min的条件下离心10 min，收集上清液备用。

3) 调糖，杀菌：加蔗糖调上清液糖度至20%，加热煮沸3 min，在75 ℃条件下水浴30 min后，置于冰水冷却至室温。

4) 发酵：酵母液（V酵母∶V2%蔗糖液=1∶10）于32 ℃水浴活化30 min，复合果酒接种0.6%（V/V）酵母液，在25 ℃电热恒温鼓风干燥箱发酵72 h。

5) 澄清：不同澄清剂对大果山楂甘蔗复合果酒进行澄清处理24 h后，于紫外分光光度计检测其透光率。

1.3 澄清剂复配比例优化

以皂土、壳聚糖、PVPP这3种澄清剂为变量因素，以复合果酒透光率为响应值，采用响应面软件Design Expert V8.0中的Box-Behnken设计进行优化，确定最优复配比例，因素水平见表1。

表1 大果山楂-甘蔗复合果酒澄清试验的因素水平表单位：g/L

1.4 复合澄清剂澄清时间的确定

在最佳复合配方的基础上，研究澄清时间为3，6，9，12，15和18 h时果酒的透光率，确定最优澄清时间。

1.5 果酒抗氧化活性的测定

澄清前、后的果酒经稀释、过滤，测定DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除率和总还原能力[3]。

2 结果与讨论

2.1 皂土、壳聚糖、硅藻土对复合果酒的澄清效果

皂土对复合果酒透光率的影响随皂土添加量增加，透光率亦上升，可能的原因是复合果酒中含有大量呈正电性的胶体物质，能与带负电荷的皂土作用而澄清[4]，透光率随着皂土的添加而上升。添加量增加到1.2 g/L，澄清后果酒透光率达到77.9%，与初始的透光率59.1%相比提高18.8%。添加量大于1.2 g/L，澄清后透光率变化幅度不大，这说明带负电荷的皂土吸附果酒中大部分带相反电荷的胶体物质，形成难溶物沉淀之后，皂土添加量继续增加，果酒的澄清度变化不大[5]。

皂土、壳聚糖、硅藻土对复合果酒的澄清效果如图1所示。壳聚糖添加量范围在0.2～0.6 g/L时，复合酒的透光率随壳聚糖的增加而逐渐上升；在0.6 g/L处澄清效果最佳，复合果酒的透光率由初始的59.1%上升至76.9%；壳聚糖添加量超过0.6 g/L时，透光率反而下降。可能是因为果酒中还存在带负电的胶体物质如蛋白质、果胶等，带正电的壳聚糖中和带负电的物质形成沉淀，达到澄清效果；但壳聚糖添加过量时，壳聚糖吸水膨胀会形成黏性较大的胶状物，悬浮于酒体中，致使酒体浑浊[6]。

图1 皂土、壳聚糖、硅藻土对复合果酒透光率的影响

硅藻土添加量范围在0.2～0.6 g/L时，复合酒的透光率随硅藻土添加量的增加呈上升趋势。硅藻土添加量0.6 g/L时，复合酒的透光率达73.5%，与原酒酒体的透光率（59.1%）相比，提升14.4%。硅藻土添加量范围小于0.6 g/L时，果酒透光率逐渐上升，这与硅藻土具有强吸附性的多孔结构有关。适量的硅藻土可吸附酒体中果胶、酵母、色素等浑浊物一同沉降，使果酒澄清。但硅藻土添加量高于0.6 g/L时，酒体澄清度随着添加量的增加呈下降趋势，可能是过量硅藻土成为浑浊物的来源[7]。

2.2 明胶、PVPP对复合果酒的澄清效果

明胶、PVPP对复合果酒的澄清效果如图2所示。明胶作澄清剂时，明胶中的蛋白质会与单宁发生化学反应，形成黏稠状物质，进而吸附果酒中的果胶、单宁等胶体物，使其形成难溶物而被去除，从而使果酒澄清[8]。明胶添加量0.02 g/L时，澄清得到的复合酒透光率（71.1%）与原酒酒体的透光率（59.1%）相比，提高12%，明胶添加量超过0.02 g/L时，复合果酒的透光率变化程度较小，这可能是由于山楂中含较多的单宁，甘蔗汁和山楂汁混合发酵过程单宁物质与酒体的蛋白质作用沉淀除去，存留在酒体中单宁物质大幅减少，明胶加入后，澄清作用不明显。

图2 明胶、PVPP对复合果酒透光率的影响

PVPP主要吸附引起果酒不稳定的单宁和多酚类物质，加入适量PVPP后，PVPP可吸附单宁絮凝沉淀，进而抑制果酒中蛋白质与单宁的结合，从而提高发酵酒的澄清度[9]。PVPP添加量在0.02～0.06 g/L时，复合果酒的透光率随PVPP添加量增加而快速上升。添加量大于0.06 g/L，透光率上升幅度不大，PVPP添加量0.1 g/L时，酒体透光率最高达75.0%。PVPP添加量高于0.1 g/L时，复合果酒的透光率下降。杨继伟[10]使用PVPP澄清甘蔗果酒，结果发现添加适量PVPP，可去除果酒中含有的多酚类物质，提高果酒透光率，而PVPP添加过量时，部分的PVPP悬浮于果酒中导致澄清度降低。

2.3 复合澄清剂配方优化试验

单因素试验结果表明，5种澄清剂对大果山楂-甘蔗复合果酒均有一定澄清效果。选取单因素试验澄清效果较好的皂土、壳聚糖、PVPP这3种澄清剂进行复配，以复合果酒透光率为指标进行响应面试验优化复配配方。17组试验结果见表2。对试验数据进行方差分析及回归系数显著性检验，结果见表3。统计模型P＜0.000 1，表明回归模型极显著。R2=0.992 8，Radj2=0.983 5，R2pre=0.913 7，表明试验误差小，模型与数据的拟合度高，模型拟合建立的二次多项式回归方程为透光率=71.8+14.6A+16.8B+68.3C-5.7AB-23.3AC-25.0BC-4.5A2-12.2B2-250.0C2。

表2 响应面试验设计及结果

表3 透光率回归模型的显著性和方差分析

该模型可以预测和分析复合澄清剂对复合果酒澄清效果的影响。在各因素中，一次项A、B对复合果酒澄清的效果极显著（P≤0.01），澄清效果的大小顺序为皂土（A）＞壳聚糖（B）＞PVPP（C），这结果与单因素试验的结果相同。二次项A2、B2和交互项AB对复合果酒澄清的效果极显著（P＜0.01），而交互项BC对复合果酒澄清的效果不显著（P＞0.1）。这表明各试验因素对复合果酒澄清效果存在一定的交互作用。

根据响应面模型，预测的复合澄清剂最佳质量浓度为皂土1.20 g/L、壳聚糖0.34 g/L、PVPP 0.06 g/L，澄清后果汁透光率为85.7%。采用所得出的最佳复合配比进行验证试验，平行测3组，试验测得的透光率为85.4%±0.8%，与模型预测基本一致，较初始的透光率提高26.3%，说明复合澄清剂效果优于单一澄清剂。

2.4 复合澄清剂澄清时间的确定

采用最优配方的复合澄清剂对大果山楂-甘蔗复合果酒进行澄清，澄清时间对果酒透光率的影响结果如图3所示。澄清时间3～12 h时，复合果酒酒体的澄清度随时间递增，澄清时间大于12 h，酒体澄清度开始下降，可能是因为静置时间长，果酒中微生物的新陈代谢作用，也会破坏果酒中胶体平衡，从而造成酒体混浊失光[11]。澄清时间9 h时，所得到的酒体透光率为89.7%±0.8%，澄清时间12 h时，所得到的酒体透光率为90.6%±0.8%，较初始的透光率（59.1%）提高30.5%。考虑到实际生产和微生物的作用，选择澄清时间9～12 h为宜。结果表明，复合澄清剂的最佳澄清时间比单一澄清剂的最佳澄清时间24 h有大幅缩短。

图3 澄清时间对复合果酒透光率的影响

2.5 澄清前后果酒抗氧化能力

大果山楂-甘蔗复合果酒在澄清前和澄清后的DPPH自由基清除能力和还原能力结果分别如图4和图5所示。结果表明，大果山楂-甘蔗复合果酒具有较好的抗氧化能力。澄清后果酒的DPPH自由基清除率略有提高，可能的原因是复合澄清剂中的皂土和壳聚糖都带有一定的电荷数，使用复合澄清剂澄清果酒后，可使酒体的电子供体增加，DPPH自由基清除率升高。澄清后果酒的总还原能力略有下降，可能的原因是复合澄清剂中的PVPP吸附具有抗氧化作用的多酚和黄酮类物质[12]。

图4 澄清前后的DPPH自由基清除率

图5 澄清前后的总还原能力

3 结论

通过5种澄清剂皂土、壳聚糖、PVPP、硅藻土、明胶对大果山楂-甘蔗复合果酒进行澄清试验，结果表明它们均有一定澄清作用，其中皂土、壳聚糖、PVPP的澄清效果较好。

在单因素试验基础上，以澄清率为指标，通过响应面优化试验对复合澄清剂配方进行优化。结果表明：皂土、壳聚糖、PVPP复合澄清剂要比单一澄清剂的澄清效果好，当复合澄清剂最佳质量浓度为皂土1.20 g/L、壳聚糖0.34 g/L、PVPP 0.06 g/L时，24 h澄清处理后大果山楂-甘蔗复合果酒透光率可达85.4%± 0.8%。复配澄清剂最佳澄清时间为9～12 h，所得到的酒体透光率最高可达90.6%±0.8%，较单一澄清剂最佳的澄清时间大大缩短。选用复合澄清剂澄清对果酒的抗氧化活性影响不大，澄清后果酒的DPPH自由基清除率略有提高，澄清后果酒的总还原能力略有下降。