呼吸道黏膜免疫及其疫苗设计

郑艺圆，朱明昭

（中国科学院生物物理研究所，北京 100101）

据世界卫生组织统计，呼吸系统疾病（包括慢性阻塞性肺病、下呼吸道感染）是全球最主要的死亡原因之一。下呼吸道感染仍是世界上最致命的传染病，居主要死亡原因的第4 位，在2019 年导致260 万人死亡[1]。由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的全球大流行也充分证明了呼吸道病原体具有强大的致病性。截至2022 年5 月，全球约有5 亿例确诊病例，其中包含624 万例死亡病例[2]。目前已上市的疫苗并未有效覆盖所有的呼吸道病原体的预防，例如预防结核杆菌、肺炎双球菌、百日咳杆菌和流感嗜血杆菌感染的疫苗虽已上市，但预防效果仍不够理想[3]。黏膜免疫策略有望覆盖这些病原体的预防，相较于注射型疫苗，黏膜途径给药疫苗（以下简称黏膜疫苗）可以引发保护性黏膜免疫反应，在感染位点阻断病原体的感染及其进一步的扩散和传播[3]。除局部黏膜免疫外，黏膜疫苗也可诱导系统性免疫应答，使机体获得全方位保护。因非侵害型给药，黏膜疫苗可大大提高病人依从性，且适用于传染性疾病大流行时的大规模接种[4]。鉴于以上优点，近10 年来黏膜疫苗研究获得广泛关注，但已批准上市且适用于人类疾病预防的黏膜疫苗的数量远少于注射型疫苗，如何优化抗原、佐剂和递送系统以提高黏膜疫苗有效性和普适性，仍然是亟待解决的问题[3]。黏膜疫苗的给药途径有呼吸道途径（鼻内给药、口部吸入）、胃肠道途径、生殖道途径等。本文将针对呼吸道感染疾病，主要介绍呼吸道途径给药的疫苗（以下简称呼吸道黏膜疫苗），通过揭示呼吸道黏膜及其相关淋巴组织的特点和防御病原体入侵的机制，获得呼吸道黏膜疫苗开发的启示，并总结有潜力的佐剂与递送系统的疫苗制剂设计，为提高呼吸道黏膜疫苗有效性和特异性提供有价值的参考。

1 呼吸道黏膜结构及免疫机制

为了理性设计呼吸道黏膜疫苗，需对呼吸道黏膜的解剖学结构、物理化学性屏障作用以及介导固有免疫反应和适应性免疫反应的分子机制有深入的了解。这些认识能辅助呼吸道黏膜疫苗设计，使得机体获得特异、长效和广谱的保护性免疫。

1.1 呼吸道黏膜的基本结构

呼吸系统由上呼吸道和下呼吸道组成。其中，上呼吸道包括鼻、咽、喉3 个胸外器官，下呼吸道分为气管、支气管、细支气管、肺泡管和肺泡。从鼻到细支气管是负责吸入气体递送的传导区，而从肺泡管到肺泡是负责气体交换的呼吸区。呼吸道黏膜由上皮层和固有层组成。上皮层及其表面黏液层组成黏膜物理化学屏障，是抵御呼吸道病原体入侵的首道防线。固有层含丰富的淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和成纤维细胞等。淋巴细胞以浸润的形式或以滤泡的形式聚集在固有层中，在病原体感染时发挥免疫效应。

1.2 呼吸道黏膜发挥物理化学屏障作用

吸入气体中的分子和颗粒异物大部分被困在黏液层，被黏膜表面持续有序的纤毛运动清除[5]。如图1 所示，上皮层由纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞和Club 细胞等组成，在持续缓慢的更新中维持各类细胞比例和平衡。上皮层之所以能形成坚固的屏障，得益于上皮细胞间的紧密连接、粘附连接和桥粒等细胞粘附相互作用[5]。纤毛细胞是呼吸道上皮层主要的细胞类型，每个细胞在顶端膜上伸出200 ～300 条基于微管的绒毛状突起。纤毛的摆动频率受多种与生理相关的信号分子[如三磷酸腺苷、环腺苷酸、NO 等]调控，纤毛的生成也受多种转录因子的调控，但呼吸道病菌或病毒可通过干扰这些调控来逃逸纤毛的防御[6]。由杯状细胞分泌的黏蛋白是黏液中最具代表性的糖蛋白，与分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）、凝集素和防御素等成分相互作用，在固有免疫中发挥重要的作用[7]。基底细胞是干细胞样祖细胞，在Notch 信号的调控下分化成纤毛细胞、杯状细胞和其他特异性上皮细胞。当上皮受损时，基底细胞迅速活化并从基底膜迁移到受损区从而形成一个临时的屏障[8]。Club 细胞则是一种圆顶状的无纤毛分泌细胞，在上皮受损时也能分化成纤毛细胞和杯状细胞[5]。

图 1 呼吸道上皮层细胞组成Figure 1 Cell composition of the airway epithelium

1.3 呼吸道黏膜免疫机制

病原体如呼吸道合胞体病毒[9]和冠状病毒[7]等可以通过干扰纤毛摆动频率、降解黏液和破坏上皮层的紧密连接等方式突破物理化学屏障，因此呼吸道黏膜产生有效的免疫反应对抵御病原体的入侵有重要意义。呼吸道上皮层中的树突状细胞（dendritic cells，DCs）可直接接触抗原，随后迁移到引流淋巴结，将抗原呈递给初始T 细胞启动一系列的适应性免疫反应。而在鼻相关淋巴组织（nose-associated lymphoid tissue，NALT）和支气管相关淋巴组织（bronchus-associated lymphoid tissue，BALT）中，由M 细胞将外部抗原转移给上皮层下的DCs 是一种重要的抗原转运方式。DCs 既能通过激活NALT和BALT 中的淋巴细胞而诱导局部免疫反应，也能迁移到引流淋巴结启动系统性免疫反应[10]。黏膜免疫系统可分为黏膜诱导位点和黏膜效应位点[11]。NALT 和BALT 是典型的诱导位点，通过对抗原的捕获、加工处理和呈递诱导适应性免疫反应。而NALT，BALT 和引流淋巴结中活化的T 细胞和B细胞可通过循环系统迁移到效应位点[7]，发挥效应功能，例如细胞毒性T 细胞将杀伤感染细胞，浆细胞将分泌大量的IgA。本文将从上皮细胞、巨噬细胞、M 细胞等方面介绍呼吸道黏膜免疫机制。

1.3.1 上皮细胞 上皮细胞表达多种模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），可快速感知病原体的威胁并启动免疫应答；上皮细胞也能作为效应细胞，表达细胞因子受体，如干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）受体和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）受体，识别免疫细胞发出的信号；上皮细胞能分泌多种细胞因子和趋化因子，与驻留或招募而来的免疫细胞（巨噬细胞、黏膜相关恒定T 细胞、组织驻留记忆T 细胞等）协同发挥呼吸道免疫功能[12]。PRRs 是黏膜免疫中重要的受体分子，由固有免疫细胞表达，识别一系列病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），介导非特异性免疫反应的产生及参与适应性免疫应答的启动和效应。PRRs 包括Toll 样 受 体（Toll-like receptor，TLR）、RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ-like receptor，RLR）和NOD 样受体（NOD-like receptor，NLR）等。上皮细胞通过TLR 识别抗原并活化，随后分泌趋化因子招募免疫细胞，免疫细胞和活化肺泡巨噬细胞分泌的TNF-α反过来作用于上皮细胞，巩固和维持TLR 起始的炎症免疫反应[12]。

1.3.2 巨噬细胞 巨噬细胞是呼吸道腔内最丰富的免疫细胞，通过与上皮细胞的相互作用对无害刺激物耐受及吸入病原体产生合适的免疫应答和有效修复组织损伤。在稳定状态时，呼吸道巨噬细胞因识别上皮细胞表达的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和CD200 等抑制性信号而被抑制活化。在感染时，上皮细胞的裂解死亡会干扰这些抑制信号。另外上皮细胞通过PRRs 识别病毒而分泌IFN-γ，巨噬细胞通过RLR 识别分泌IFN-α/β。这些干扰素能诱导上皮细胞进入抗病毒状态。IFN-γ、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）和IL-22 使巨噬细胞加强对感染细胞和病原体的吞噬作用，使上皮细胞分泌抗菌肽，加强紧密连接，促进增殖和修复等[10]。

1.3.3 M 细胞 覆盖黏膜滤泡的“滤泡相关上皮”中有一种特化的上皮细胞，称为M 细胞，能将呼吸道腔中的大分子物质和微生物通过“胞吞转运”作用转送给上皮层下的抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APCs）。M 细胞转运抗原是启动黏膜免疫反应、产生抗原特异性IgA、维持黏膜组织稳态的关键步骤[13]。与肠系M 细胞相同，核转录因子κB 的受体激动剂（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK） 及其配体RANKL 相互作用通路是诱导NALT 和BALT 中M 细胞（GP2+Tnfaip2+）分化的重要通路[14]。Kimura 等[14]发现呼吸道M 细胞在自身免疫性疾病模型小鼠的诱导型BALT 中出现。另外，在呼吸道疾病小鼠模型中，呼吸道M 细胞在淋巴细胞浸润的气管上皮中被病理性诱导产生，提示气道M 细胞是诱导型BALT 的关键元件且在黏膜免疫中发挥重要作用[14]。M 细胞“胞吞转运”的分子机制尚未完全解析。目前已知M 细胞表面受体GP2是介导“胞吞转运”的重要受体，M 细胞表达的胞浆蛋白异体移植炎症因子1 和TNF-α 诱导蛋白2 能够调节M 细胞的转运能力[13]。

1.3.4 树突状细胞 呼吸道DCs 广泛分布在上皮内、固有层中以及肺组织中，形成一个相互连接的网络，通过PRRs 识别病原体并被激活，区分外来的有害或无害物质从而诱导合适的免疫应答或免疫耐受以维持机体稳态[11]。DCs 通过吞噬作用、巨胞饮作用和受体介导的内吞作用来摄取病原体，其中受体介导的内吞作用大部分是通过PRRs 识别PAMPs，具有高效、选择性和饱和性等特点[11]。因此这些受体是疫苗设计的重要靶点。未成熟的DCs 需通过直接或间接方式活化：未成熟DCs 通过PRRs 识别吸入的病原体颗粒或可溶性抗原，可以直接活化；上皮细胞通过分泌趋化因子招募单核细胞，通过分泌IL-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和胸腺基质淋巴细胞生成素等细胞因子促单核细胞分化为DCs 并促进DCs 成熟为完全APCs；气道上皮细胞分泌的Ⅰ型干扰素可调控DCs 的成熟[15]。

呼吸道DCs 具有多种作用：抗原呈递作用，成为连接固有免疫反应和适应性免疫反应的桥梁；诱导B 细胞进行IgA 类别转换；介导免疫耐受[11]。DCs 迁移到淋巴结，将抗原呈递给初始CD4+T 细胞和初始CD8+T 细胞并促其活化、增殖和分化。CD4+T 细胞分化为Th1，Th2，Th17 和滤泡辅助性T 细胞（T follicular helper cells，Tfh）等。Tfh 可诱导B 细胞发生体细胞高频突变和抗体类别转换，在生发中心中抗原高亲和力的B 细胞被筛选出并发展成长效浆细胞和记忆B 细胞。浆细胞分泌抗原特异性抗体介导体液免疫反应。DCs 通过分泌细胞因子IL-10，TGF-β 和IL-6，诱导CD4+T 细胞分泌IL-4和IL-10，以及直接将完整蛋白抗原呈递给B 细胞等方式诱导B 细胞IgA 类别转换。

1.3.5 鼻相关淋巴组织 鼻咽扁桃体和咽鼓管扁桃体是Waldeyer 氏环的一部分，是人体中典型的NALT。NALT 位于上呼吸道，是最早接触病原体的黏膜相关淋巴组织，与小肠的派尔小结一样具有典型的滤泡相关上皮（包含M 细胞）、滤泡区（B 细胞区）、滤泡间区（T 细胞区）、输出淋巴管和高内皮静脉等结构[9]。与派尔小结不同的是，NALT的生发中心是在出生后由抗原诱导形成的[16]。

1.3.6 支气管相关淋巴组织 BALT 是位于下呼吸道的黏膜相关淋巴组织，结构与NALT 相似。如图2 所示，BALT 是具有B 细胞滤泡和组织学上可辨认的滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells，FDCs）的淋巴细胞集群[17]，但这些淋巴细胞集群可能并不含有明显的T 细胞区和特异的基质细胞。在人体中，BALT 并不是组成型存在的，而是出生后因微生物暴露或其他的炎症反应等诱导产生。

图 2 支气管相关淋巴组织的结构Figure 2 Structure of bronchus-associated lymphoid tissue

在圆顶状上皮层中，特异的无纤毛上皮细胞M细胞负责将呼吸道腔的抗原转移给DCs。B 细胞滤泡区是BALT 最突出的结构特征，其主要的细胞成分是IgDhighIgMlow成熟静息B 细胞[18]，通常含有生发中心。BALT 中存在生发中心，意味着B 细胞应答可在局部持续发生。FDCs 位于B 细胞滤泡区的中心，对B 细胞的活化和增殖有重要作用。高内皮静脉常见于T 细胞区或在B 细胞区与T 细胞区的分界，通过表达重要的归巢信号分子来招募外周的T细胞和B 细胞到达BALT[17]。

NALT 和BALT 是诱导局部黏膜免疫反应的重要位点，在平衡免疫应答和避免组织损伤与过度炎症中起重要作用，而且相比系统性免疫应答更迅速，有利于在上、下呼吸道均建立免疫屏障。NALT 和BALT 的作用机制包括：1）B 细胞在生发中心中发生体细胞高频突变和亲和力选择，最终增殖分化为长效浆细胞和记忆B 细胞；2）B 细胞免疫反应产生IgA，分泌型IgA 在黏膜免疫中起重要作用；3）T 细胞免疫应答的诱导和发生，BALT 辅助记忆性T 细胞活性的维持；4）记忆性细胞在交叉免疫保护中起重要作用[17]。

1.3.7 B 细胞和免疫球蛋白A B 细胞在NALT 和BALT 等淋巴组织中应答、分化和成熟，介导一系列重要的免疫应答。例如，在小鼠研究中，生发中心产生具有交叉反应特性的B 细胞库，生成能够广谱应答的组织驻留记忆B 细胞。这些记忆B 细胞在接触病原体后能快速产生高亲和力抗体防御多种亚型流感病毒[19]。B 细胞在不同微环境和不同类型免疫反应中发生不同的类别转换，其中IgA 型B 细胞在黏膜免疫中发挥重要作用[17]，IgA 在呼吸道黏膜中大量表达[11]。

IgA 分为血清型IgA 和分泌型IgA（sIgA），血清型IgA 主要以单体形式存在血液中，而sIgA是以多聚体形式（且大多为二聚体）广泛存在于黏膜，是黏膜免疫的首道防线。在上皮下的浆细胞分泌IgA 单体和J 链，二者形成IgA 二聚体，与上皮细胞基底膜侧的分泌片（secretory component，SC）结合形成IgA-J 链-SC 复合体（即sIgA）。sIgA 由上皮细胞表达的多聚免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor，pIgR）介导从固有层转移到呼吸道腔[11,20]。

sIgA 功能多样[20]，其一是“免疫排除”：在黏液层结合吸入的病原体，辅助病原体在纤毛运动下清除；在上皮细胞中拦截正在侵入的病毒，携带病毒转送至呼吸道腔；在固有层中结合侵入的病原体然后通过pIgR 作用转运至呼吸道腔。其二是辅助抗原呈递，结合病原体的sIgA 被M 细胞摄取并转运给上皮下的DCs。

1.3.8 组织驻留记忆T 细胞 除了B 细胞免疫反应，黏膜免疫也需要有效的T 细胞免疫反应，其中组织驻留记忆T 细胞（tissue-resident memory T cells，TRM）在再次应答中发挥重要作用。在BALT 中，记忆T 细胞能稳定增殖，不但可以快速阻断相同病原体的再次入侵，还可以促进不同病原体的清除[17]。例如，鼻内免疫一款融合SARS-CoV2 的S 抗原的黑猩猩腺病毒载体疫苗（ChAd-SARS-CoV-2-S）后，小鼠的肺部检测到SARS-CoV2 特异性CD8+T 细胞，特别是CD103+CD69+T 细胞（TRM细胞表型）[21]。这意味着呼吸道黏膜疫苗能通过BALT 等结构诱导效应T 细胞和病毒特异性TRM细胞，使小鼠在遇到相同抗原时能更快启动免疫应答[21]。在流感病毒研究中也发现，CD8+TRM细胞具有交叉保护作用，对小鼠抵御异亚型病毒的肺部感染至关重要。CD8+TRM细胞在感染后出现在上呼吸道，能清除异亚型流感病毒并阻断病毒从上呼吸道脱落至下呼吸道，避免引发更严重的肺部疾病[22]。

2 呼吸道黏膜疫苗现存的问题和挑战

呼吸道黏膜疫苗虽然具有广阔的研发前景，但仍面临许多问题和挑战。首先，黏膜物理化学屏障不仅阻挡病原体的入侵，也干扰了疫苗的摄取。呼吸道黏膜上皮层的紧密连接结构和纤毛的摆动使得疫苗不易被摄入、停留时间过短、易于被清除至体外。黏液中的天然抗体、蛋白酶、核酸酶等物质容易破坏和降解疫苗。这些都使得疫苗无法通过上皮层，无法接触NALT/BALT 的淋巴细胞以启动保护性免疫应答[4,19]。其次，呼吸道黏膜也具有一定的免疫耐受性以避免非病原体引发损伤性炎症反应。单纯使用抗原而不加佐剂的疫苗很可能诱发黏膜产生T细胞和B 细胞耐受[4,19]。再次，一直以来流感减毒活疫苗的安全性问题阻挠其获批[16]，许多非减毒灭活类型的疫苗正等待研发和临床试验。因此，通过疫苗制剂设计（包括佐剂和递送系统）来增强疫苗的稳定性、完整性和有效摄入是非常必要的，但如何平衡制剂的安全性和有效性也是一大难题[19]。另外，常用的注射型疫苗佐剂未必适合于呼吸道给药，很多已批准的肌肉注射疫苗佐剂还待临床试验证明其在呼吸道给药中的安全性和有效性[16]，同时还需要开发新型佐剂和递送系统以实现呼吸道黏膜疫苗设计愿景。接下来，本文将梳理并介绍当前发展成熟的佐剂与递送系统。

3 佐剂

佐剂通常指添加到疫苗中帮助提高其免疫原性的物质。黏膜佐剂按作用不同可大致分为3 类：黏膜附着剂、渗透增强剂和免疫刺激剂等[16]。黏膜附着剂通常是无毒的有机聚合物，在黏液中会吸水膨胀并与上皮细胞非共价结合，抑制纤毛摆动，从而增加抗原在黏膜中的保留时间，促进抗原与上皮细胞结合。渗透增强剂可促进抗原在上皮细胞外穿过上皮层，主要机制是干扰或破坏上皮细胞间的“紧密连接”。免疫刺激剂主要通过靶向各种免疫细胞及其信号通路激活固有免疫细胞、活化DCs 启动适应性免疫应答。接下来将对代表性佐剂展开阐述。

3.1 渗透增强剂

霍乱毒素（cholera toxin，CT）和大肠埃希菌热不稳定毒素（Escherichiacoliheat-labile toxin，LT）是研究最成熟的黏膜佐剂[4]，通过与GM1-神经节苷脂受体（在大多数有核细胞表面存在）结合，增强黏膜屏障通透性并促进局部APCs的招募与激活。但是CT 和LT 均为全毒素，自身的毒性限制其临床应用，例如LT 会引发严重的副作用——“贝尔面瘫（Bell’s palsy）”。因此，仅使用CT 的非毒性A1 亚基（CTA1）作为佐剂是有潜力的替代方案。另外，CTA1 融合了人工合成的结构域DD 后（称为CTA1-DD）能很好地靶向B 细胞和FDCs，促进生发中心的形成，其良好的安全性和免疫刺激性得到临床前试验证明[23]。

3.2 黏膜附着剂

黏膜附着剂包括壳聚糖、聚γ-谷氨酸、淀粉、海藻酸钠、聚羧乙烯等聚合物。壳聚糖是由甲壳质去乙酰化得到的一种带正电的多糖聚合物，可生物降解且具有很好的安全性。壳聚糖的去乙酰化水平和方式、相对分子质量等会影响其溶解性、生物相容性与生物降解性能。壳聚糖有多种佐剂效应：通过与带负电的黏液结合，显示出很强的黏膜附着特性；通过诱导紧密连接的可逆打开来增强黏膜通透性；通过激活NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症小体促进Th1 细胞的极化；促进DCs 活化诱导细胞免疫；参与“干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）-环磷酸鸟苷-腺苷一磷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）”通路启动固有免疫和适应性免疫应答[24]。Shim 等[25]研究了运载布鲁菌3 种重组蛋白的壳聚糖纳米颗粒的鼻内给药效果。结果表明，在小鼠模型中，壳聚糖纳米颗粒能有效促进Th2 型免疫应答和抗原特异性IgA 及各种类型的IgG 生成。许多研究通过不同修饰来提高壳聚糖的黏附作用和免疫刺激性，例如Mosafer 等[26]在小鼠中鼻内给予被佐剂包裹灭活的PR8 流感病毒，比较了壳聚糖与三甲基修饰的壳聚糖这2 种佐剂的差异。结果显示，两者均诱导出高水平抗原特异性IgG 抗体，与三甲基修饰的壳聚糖疫苗相比，壳聚糖疫苗能诱导更高水平的IgG1 和IgG2a。

3.3 免疫刺激剂

靶向性佐剂具有很好的免疫刺激活性，例如靶向M 细胞受体促进抗原通过上皮层；靶向TLR 和STING 通路等激活DCs 和一些固有免疫细胞，促进DCs 启动一系列免疫应答。

M 细胞的研究大多来自肠系M 细胞，其与呼吸道M 细胞存在差异。因此，口服M 细胞靶向的佐剂在呼吸道给药中的效果仍需验证[16]。糖蛋白-2（glycoprotein-2，GP-2）是M 细胞表面特异性表达的蛋白。Khan 等[27]通过噬菌体展示文库筛选出与GP-2 高亲和力结合的短肽Gb-1，并验证了其作为鼻内给药疫苗佐剂的效果。结果表明，Gb-1 能与鼻黏膜M 细胞有效结合，FG-Gb1 疫苗（Gb-1 与呼吸道合胞病毒的F 和G 蛋白偶联）鼻内给药BALB/c小鼠后诱导了Th1 型免疫反应和保护作用。相比未加佐剂的FG 抗原，FG-Gb1 显著提高了IgA 和中和抗体诱导水平，并显著降低了肺部病毒载量，减少了小鼠在接触病毒后的体质量下降。类似地，由Park 等[28]筛选出能与M 细胞特异性结合的短肽Co4B，其能将抗原靶向NALT。为了证明佐剂Co4B 的作用，结合和不结合Co4B 的胸膜肺炎放线杆菌抗原分别被鼻内注入小鼠，结果表明佐剂Co4B 能有效提高血清IgG和分泌型IgA 水平，促进肺部残留病菌的清除。

TLR 是重要的模式识别受体，因此也成为黏膜佐剂的重要靶点。TLR 激动剂主要通过与DCs 的TLR结合，促进抗原被DCs 捕获，从而激活DCs 启动一系列免疫应答，特别是Th1 型免疫反应[16]。实验证明TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7 和TLR9的激动剂可以加强鼻内疫苗的免疫原性[4,16,19]。

TLR3 激动剂聚肌苷酸-胞苷酸[poly(I: C)]是合成的双链RNA 类似物，通过模仿病毒RNA 活化多种APCs[19]。一项研究表明poly(I: C)能有效提高H1N1 病毒疫苗产生血清IgG 和黏膜IgA 的水平，而且促进NALT 中生发中心的形成、提高B 细胞和Tfh 应答，而这些是通过活化鼻黏膜CD103+DCs 介导的。与不加佐剂的疫苗组相比，poly(I: C)佐剂组能有效保护小鼠对抗H1N1 病毒感染[29]。

TLR5 激动剂鞭毛蛋白是来自细菌鞭毛的主要蛋白，能靶向呼吸道上皮细胞、DCs 和其他淋巴细胞表面的TLR5，促进抗原经上皮转运和诱导DCs迁移到上皮层[19]。Song 等[30]将H7N9 抗原HA1-2短肽与鼠伤寒沙门菌的鞭毛蛋白fliC 融合表达（命名为HA1-2-fliC），验证鞭毛蛋白的佐剂效应。结果表明，与不加佐剂的抗原相比，HA1-2-fliC 显著增加了血清IgG 和支气管肺泡灌洗液中IgA 水平。HA1-2-fliC 诱导的IgG1/IgG2a 比值为0.9，HA1-2-fliC 免疫后小鼠脾细胞中分泌IFN-γ 和IL-4 的细胞数量相当，这些表明HA1-2-fliC 既能诱导Th1 型免疫反应也能诱导Th2 型免疫反应。

TLR9 激动剂CpG 是寡聚脱氧核苷酸，有相关研究提示其可以通过促进上皮细胞分泌趋化因子CCL20 招募DCs 到上皮层，促进DCs 捕获呼吸道腔内抗原[31]。在甲型流感病毒H7N9 疫苗的鼻内给药研究中发现，佐剂CpG 有效提高血清、NALT 上清液以及支气管肺泡灌洗液中的IgG 和IgA 水平，还能提高长效IFN-γ+T 细胞水平。在用H7N9 病毒感染小鼠后，未使用佐剂的鼻内免疫组小鼠死亡率达60%，存活小鼠体质量均下降；相反，使用佐剂的鼻内免疫组小鼠存活率100%，仅在感染初期发生体质量轻微下降[32]。

STING 信号通路能产生Ⅰ型干扰素和促炎因子，在固有免疫反应中发挥重要作用，因此能启动STING 信号通路的环二核苷酸（cyclic dinucleotide，CDN）也是黏膜疫苗佐剂的重要候选物。许多研究团队将CDN 作为呼吸道黏膜疫苗佐剂，证明其可以促进趋化因子CXCL1，CCL2，CCL3，CXCL2，CCL5 的分泌和炎症细胞的招募，显著增强CD11c+细胞对抗原的摄取，可以明显提高血清IgG 和黏膜IgA 水平，增强宿主对各种致病菌感染的抵抗力，例如流感病毒、百日咳杆菌和肺炎链球菌等[33]。

4 递送系统

除了通过佐剂来提高抗原的免疫原性，还需要递送系统来为抗原“保驾护航”。只有让抗原完整到达免疫诱导部位，才有望激活免疫反应。例如重组蛋白疫苗和核酸疫苗的抗原都是大分子物质，很难穿过复杂的黏膜屏障，必须使用递送系统将抗原转运到合适部位诱导免疫应答。递送系统的作用，一是保护抗原免受黏液中蛋白酶、核酸酶和sIgA等物质的降解；二是确保抗原与佐剂能共同递送；三是延长疫苗在黏膜的保留时间；四是增加大分子抗原的体积以促进局部黏膜免疫，原因是太小颗粒的抗原易逃逸局部加工处理而直接扩散到输出淋巴管，导致局部黏膜免疫耐受[34-35]。不同于注射型疫苗，呼吸道黏膜给药的抗原需以颗粒形式展示才能被APCs 识别进而激活局部和系统性免疫应答[35]。颗粒的直径也很大程度上导致不同的免疫应答类型：20 ～ 300 nm 颗粒偏向引起细胞免疫，其中200 ～300 nm 颗粒是最理想的能被DCs 摄取的颗粒，颗粒越小T 细胞免疫反应越强；大于500 nm 的颗粒容易引发体液免疫；大于5 μm 的颗粒可被M 细胞摄取，但只能引起一定的黏膜免疫反应而不能引发系统性免疫反应[9,35]。递送系统按组成成分不同可分为多聚体颗粒、无机颗粒、脂类颗粒、病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）、自组装蛋白颗粒、病毒载体和细菌载体等，本文主要介绍发展成熟的几款递送系统。需要说明的是，递送系统也可能有佐剂效应，一部分是材料本身具有佐剂效应，另一部分是通过将佐剂与递送系统结合增加了后者的靶向作用。

4.1 多聚体颗粒

多聚体颗粒通常由生物可降解的高分子材料组成，可分为天然多聚物和合成多聚物两大类。天然多聚物包括壳聚糖、透明质酸、普鲁兰淀粉纳米颗粒、海藻酸钠盐纳米颗粒等；合成多聚物包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(D，L-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、聚乳酸[poly(lactic acid)]、聚己酸内酯纳米颗粒、聚酸酐纳米颗粒、聚磷腈纳米颗粒等[36]。多聚体颗粒因其生物兼容性、生物降解性、无毒性以及方便修饰成所需形状和尺寸等特点而得到广泛研究。

上一部分提到了壳聚糖的佐剂效应，实际上壳聚糖颗粒也是非常合适的鼻内免疫递送系统。壳聚糖颗粒有较大的容载量，可延长抗原在黏膜的保留时间，易通过修饰控制抗原的释放速率，可促进DCs 摄取抗原，在小鼠、兔、鸡、猪和牛等动物模型中均显示出良好的递送能力[37]。同时拥有佐剂效应和递送能力的壳聚糖颗粒既能诱导强烈的黏膜免疫反应也能诱导有效的系统性免疫应答，是呼吸道黏膜疫苗的理想递送系统。

PLGA 是另一个研究成熟的且获得美国FDA 批准的有机多聚体递送系统。PLGA 是由乳酸和羟基乙酸混合形成的共聚物，乳酸的比值越大，PLGA的生物降解速率越小。因此，可通过改变乳酸和羟基乙酸二者比值来影响包裹在PLGA 内抗原的释放速率或控制抗原的持续释放，进而影响免疫反应[38]。例如，在一项研究中对比了脂质-抗原肽被PLGA包裹其中（称为NPs-1）或吸附在PLGA 表面（称为NPs-2）这2 种形式疫苗的效果。结果显示，不加载体的脂质-抗原肽与NPs-1 和NPs-2 均能被DCs 捕获，但脂质-抗原肽组无法有效激活APCs，而NPs-1 和NPs-2 均显著提高APCs 表面成熟标志物的水平，说明递送系统PLGA 能辅助抗原活化APCs；同时，NPs-1 比NPs-2 更有效地促进了抗原特异性IgG 和IgA 的表达，这可能与NPs-2 表面抗原更易脱落有关[39]。

4.2 无机颗粒

一些生物相容性的无机材料如金、银、铂、硅和碳等也可以形成颗粒，即无机颗粒，作为黏膜免疫疫苗的递送系统[40]。无机颗粒载体拥有许多优势，比如免疫惰性，即载体本身不具有免疫原性；尺寸和形状可控；表面易修饰等。Tao 等[41]将金纳米颗粒作为鼻内免疫的流感疫苗的载体，提高了流感病毒M2e 肽的免疫原性。

4.3 脂类颗粒

基于脂质的递送系统是指主要成分含有脂质的一类颗粒状载体，包括脂质体、脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）、病毒小体、免疫刺激复合物等。脂质体的基础结构是磷脂双分子层和亲水核心，是直径在几十纳米至几微米的球形载体，按形态可以分为单层磷脂双分子层脂质体、多层同球心磷脂双分子层脂质体和多囊泡脂质体[42]。脂质纳米颗粒由阳离子脂质/可电离脂质和其他辅助性脂质（如磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰脂）组成[43]。病毒小体是一类特殊的脂类颗粒，通过重建病毒包膜（含磷脂和包膜蛋白）来模拟病毒从而提高其载体效应[44]。免疫刺激复合物是抗原与胆固醇、磷脂和皂苷QuilA混合后自发形成的带负电荷的五角形十二面体，具有环状稳定结构[19]。

本文主要以脂质体和LNPs 为例介绍脂类颗粒递送系统。脂质体的组成成分、形态结构和修饰等会影响其递送。例如磷脂尾部基团的不饱和键数量和长度会影响脂质体的流动性和渗透性；头部基团主要决定脂质体的表面电荷，其中正电荷的递送系统更有利于与表面负电的DCs 结合；胆固醇含量对脂质体的稳定性有重要影响[19,45]。脂质体和LNPs携带抗原的方式（抗原被包裹在颗粒内或吸附在颗粒表面）也会影响免疫应答[19,45]。此外，可以通过多种方式修饰脂质体和LNPs 并将多种佐剂与递送系统结合以诱导有效的免疫应答，例如通过静电作用和共价结合在颗粒表面修饰佐剂或抗原；混合脂类佐剂到磷脂双分子层内部；包裹佐剂和抗原到颗粒内部[45]。

Tada 等[46]为了研究阳离子脂质体在鼻内给药疫苗中的作用，将卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 混合阳离子脂质体后鼻内免疫小鼠。结果表明，对比仅免疫OVA 组，阳离子脂质体+OVA 组显著提高了OVA 特异性黏膜IgA 和血清IgG 的表达，有效诱导IL-6 在鼻道和脾脏中的分泌。该团队也证明了IL-6的分泌对鼻黏膜抗原特异性IgA 的分泌有重要影响。

Bernasconi 等[47]通过在LNP 表面共价结合抗原复合物和（或）包裹抗原复合物在亲水核心内来验证LNPs 是否能促进抗原复合物诱导有效的免疫反应和预防效果。抗原复合物是甲型流感病毒M2e肽融合CTA1-DD 后形成的多肽，通过硫醇-马来酰亚胺反应与LNP 表面融合了马来酰亚胺的脂质（或聚乙二醇）共价结合。聚乙二醇能提高LNP 表面结合蛋白的容载量以及增加LNP 在体内的保留时间。结果表明，相比单纯鼻内免疫抗原复合物，通过LNP 递送抗原复合物能在呼吸道局部有效诱导强烈的抗原特异性IgA表达以及Th1和Th17型免疫应答、提高肺部驻留CD4+T 细胞水平。LNP 递送抗原复合物鼻内免疫后的小鼠在高毒性流感病毒感染后存活率明显提高。

4.4 病毒样颗粒

VLPs 是由一种或多种病毒蛋白组装成的模拟病毒形态的递送系统。VLPs 大小和结构都与病毒粒子相似，具有免疫原性而无感染性，其表面可以展示高度重复的抗原表位。有许多病毒蛋白能自组装成VLPs，例如流感病毒M1 蛋白、乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）核心蛋白、噬菌体Qβ 衣壳蛋白和诺如病毒衣壳蛋白突出结构域（protrusion domain，P-domain）。部分VLPs 自身即是抗原，例如流感病毒VLPs 和HBV-VLPs，可直接作为相应病原体的预防性疫苗；另一部分VLPs 通过表面修饰抗原或内部包裹抗原成为很好的递送系统，例如Qβ-VLPs 和P-VLPs[19]。

在呼吸道给药疫苗研究中，流感病毒VLPs 的研究相对成熟，一项研究表明H1N1-VLPs 鼻内给药能诱导有效的保护性免疫反应。该团队重组表达H1N1 流感病毒的H1，N1 和M1 蛋白并获得这3 种蛋白组装而成的VLPs。相比肌肉注射，鼻内免疫VLPs 能在支气管和肺部诱导更高浓度的炎症相关细胞和淋巴细胞，且伴随肺部CD11bhigh和CD103+DCs数量的增加，鼻内给药VLPs 能诱导更强的T 细胞反应且偏向Th1 型免疫应答[48]。流感病毒VLPs 有望解决流感病毒多亚型、易变异等问题，方法是混合多亚型流感病毒抗原构建多效价的VLPs 疫苗，以及添加佐剂修饰VLPs 促进其成为广谱流感疫苗[49]。

Bessa 等[50]通过Qβ-VLPs 递送流感病毒M2 蛋白，研究该疫苗在鼻内给药和肌肉注射2 种途径下的免疫效果。结果表明，鼻内给药和肌肉注射均能诱导强烈的抗原特异性IgG 反应，但是鼻内给药更能诱导肺部IgA 的分泌。鼻内给药M2-Qβ-VLPs 能有效保护小鼠，使所有小鼠在致死剂量H1N1 病毒感染后存活下来。

4.5 自组装蛋白颗粒

自组装蛋白由多个重复蛋白自组装成颗粒，可以包裹或吸附抗原。铁蛋白自组装蛋白递送系统在鼻内免疫中也得到了广泛研究和应用。一项研究表明铁蛋白递送系统能在没有佐剂的辅助下诱导强烈的免疫应答和有效的保护。该团队将表面共价结合流感病毒M2 蛋白的铁蛋白纳米颗粒通过鼻内免疫小鼠，使小鼠获得呼吸道黏膜和系统性免疫保护，并在同型H1N1 和异型H9N2 病毒的致命感染下存活。这项研究提示铁蛋白纳米颗粒能有效提高抗原的免疫原性以及提供交叉免疫保护[51]。

4.6 病毒载体和细菌载体

作为感染人类的病毒和细菌，其本身也能成为递送系统，递送抗原的模式可分为以下3 种：1）将病原菌或病毒减毒后作为载体；2）重组改造非致病的细菌或病毒，使其表达抗原，然后将其作为疫苗；3）重组有活性的非致病的细菌或病毒携带抗原相应的DNA，使细菌或病毒感染人类后在体内表达抗原[52]。

以腺病毒载体为例介绍。腺病毒载体具有以下特点：免疫激活性，腺病毒载体含有多种PAMPs，能激活宿主多条固有免疫反应通路，诱导促炎因子的分泌而影响未成熟DCs 的分化；容载量大，能装载6 ～ 35 kb 外源基因；相对的安全性；能诱导强烈的固有免疫和适应性免疫反应。针对流感、呼吸道合胞病毒综合征和COVID-19 等多种疾病的腺病毒载体疫苗已进入临床研究阶段。另外，腺病毒载体也是开发通用型流感疫苗的非常有潜力的途径，例如让腺病毒载体表达多种流感病毒高度保守抗原M1，M2 和HA2 以促进机体获得对各亚型流感病毒的保护性免疫[53]。腺病毒载体广泛应用于COVID-19 疫苗的开发，将在下一部分详述。

5 呼吸道途径给药的COVID-19 疫苗

呼吸道黏膜疫苗虽已经被研究多年，但已上市的仅5 款且均为减毒灭活疫苗[16]。然而在COVID-19的全球大流行背景下，呼吸道黏膜疫苗的开发取得不小进展。据世界卫生组织统计，截至2022 年5 月3 日，已有13 款呼吸道途径给药的COVID-19 疫苗（以下简称呼吸道给药新冠疫苗）进入临床试验阶段，而且包含腺病毒载体和蛋白亚单位等多种类型的疫苗（见表1）。呼吸道给药新冠疫苗取得的进步将带动其他呼吸道黏膜疫苗的开发，以下将阐述新冠疫苗在呼吸道给药研究中取得的进展，为呼吸道黏膜疫苗的开发提供一定的参考。

表 1 进入临床阶段的呼吸道给药的新型冠状病毒肺炎疫苗[54]Table 1 Respiratory mucosal vaccines against COVID-19 in clinical trials [54]

大部分新冠疫苗只能预防下呼吸道感染或避免患病，并不能实现上呼吸道的“消除性免疫”，这意味着病毒仍然可能在已接种疫苗人群中传播，而呼吸道给药新冠疫苗有望阻断病毒在上、下呼吸道的感染及随后的传播，具有很高的研发价值[55]。ChAdOx1 nCoV-19 是已上市的新冠疫苗之一，给恒河猴肌肉注射该疫苗后虽能预防其肺部感染和肺炎，但不能避免上呼吸道感染和阻断病毒脱落[56]。于是相关团队对ChAdOx1 nCoV-19 的鼻内给药方式展开试验，结果表明在仓鼠和恒河猴动物模型中，鼻内给药该疫苗均能诱导强烈的黏膜免疫和体液免疫反应。接触感染了SARS-CoV2 的仓鼠后，鼻内免疫组仓鼠比肌肉注射组显示出更强的保护性免疫：鼻内免疫组小鼠咽拭子中病毒RNA 和感染性病毒含量更低，肺组织中未检测出感染性病毒或病毒RNA，而肌肉注射组4 只仓鼠中有3 只出现轻微的间质性肺炎[57]。目前鼻内给药ChAdOx1 nCoV-19 疫苗已进入Ⅰ期临床试验。另一项Ⅰ期临床试验对比了腺病毒载体疫苗Ad5-nCoV 在雾化吸入、肌肉注射以及2 种途径混合给药中的安全性、耐受性和免疫原性。结果表明，2 剂剂量的雾化吸入Ad5-nCoV 疫苗（相当于1 剂肌肉注射疫苗剂量的1/5或2/5）在18 岁及以上成年人中显示出良好的耐受性，且未引发严重的不良反应。接种2 剂雾化吸入Ad5-nCoV 疫苗（相当于1 剂肌肉注射疫苗剂量的1/5）后，在第28 天测试志愿者血清中的抗体水平。雾化吸入Ad5-nCoV 疫苗诱导的能够结合受体结合域（receptor-binding domain，RBD) 的 IgG 和IgA水平低于肌肉注射疫苗诱导的相应抗体水平，但2种途径诱导的中和抗体水平相近。雾化吸入Ad5-nCoV 疫苗能诱导抗体和Th1 型免疫反应，而混合给药（第1 剂肌肉注射，第2 剂雾化吸入）比单独途径给药产生更好的免疫应答[58]。

新冠疫苗开发的另一个挑战是能否有效应对SARS-CoV2 变异体。许多进入临床试验的呼吸道给药新冠疫苗在动物模型试验中显示出很好的交叉免疫，例如在敲入人类血管紧张素转化酶2 基因的小鼠中，ChAd-SARS-CoV-2-S 展示出对B.1.351 和B.1.1.28 突变株的模拟病毒产生交叉保护作用[59]。另外，佐剂和递送系统能通过诱导广谱中和性抗体以及长效CD4+和CD8+T 细胞来辅助新冠疫苗增强交叉免疫反应和长期保护能力。有研究表明SARSCoV2 会通过几种免疫逃逸机制，如逃逸RLR 识别机制（机体识别病毒双链RNA 的机制）和抑制RIG-Ⅰ蛋白表达与下游效应因子的分泌，使得关键的Ⅰ型干扰素分泌减少，最终导致固有免疫应答减弱。适当的固有免疫应答对随后的T 细胞活化和抗体亲和力成熟具有重要影响。因此诱导合适的固有免疫能促进持久的、有效的适应性免疫反应。基于此，Jangra 等[60]组合了3 种重要的固有免疫PRR的配体，分别是纳米乳剂（TLR 激动剂和NLRP3激动剂）和IVT DI（RIG-Ⅰ激动剂），以此为佐剂及递送系统结合SARS-CoV2 S1抗原构成新冠疫苗。该新冠疫苗显著提高小鼠血清中和抗体水平并增强Th1 型免疫应答，而且展示出对B1.1.7，B.1.351 和P.1突变体很好的交叉免疫保护作用。

6 总结和展望

呼吸道感染是全球公共健康问题，特别是SARS-CoV2 仍在全球肆虐。呼吸道黏膜免疫对人类抵御呼吸道传染性疾病的侵害十分重要，因此本文总结了呼吸道黏膜结构和免疫机制及其对呼吸道黏膜疫苗开发的重要提示。呼吸道黏膜疫苗具有以下特点：1）能同时诱导局部免疫和全身性免疫，黏膜局部免疫应答有利于诱导组织驻留记忆性细胞，促进机体在接触病原体时迅速诱导特异性免疫反应；2）有望在上、下呼吸道均建立免疫屏障，该屏障不仅能有效避免接种人员自身的感染，也能真正阻断呼吸道病原体在人群中的传播；3）有望诱导交叉免疫应答，以应对容易突变的病原体。为了真正实现呼吸道黏膜疫苗的优势，需设计出有效的疫苗制剂，特别是开发出适用于呼吸道途径给药的佐剂和递送系统。因此，本文梳理了当前研究相对成熟且有潜力的佐剂和递送系统，希望能促进呼吸道黏膜疫苗的开发。

呼吸道黏膜疫苗开发面临许多挑战。首先，面对容易突变的病原体，特别是流感病毒和SARSCoV2，需开发具有广谱免疫效果的疫苗。目前已上市的呼吸道黏膜疫苗仅有流感的减毒疫苗，均未使用佐剂，而且因为流感病毒容易变异，这些疫苗在真实世界使用的有效性不佳[61]。因此广谱流感疫苗亟待开发，例如使用其他类型疫苗（如重组亚单位疫苗和病毒载体疫苗等），使用合适的佐剂和递送系统促进交叉免疫反应等。但是已获得批准的黏膜给药佐剂和递送系统数量有限，这也是亟待解决的问题。

其次，部分疫苗特别是新冠疫苗保护时长有限，需开发长效保护性疫苗。延长疫苗的保护时长关键在于黏膜组织驻留记忆性细胞的寿命。在小鼠感染甲型流感病毒后，肺部中CD8+TRM的寿命相对较短（半年左右），损害了后续病毒感染的保护能力。随后的研究表明，在鼻内免疫疫苗后，静脉注射疫苗诱导的全身性免疫能维持肺部CD8+TRM的稳定存在。提示可以针对呼吸道感染疾病设计黏膜免疫和全身性免疫混合接种的疫苗。另外，组织驻留的记忆性B 细胞和TRM需要肺部驻留的辅助性T 细胞的支持以应答病毒感染，这些细胞都是促进长期免疫记忆性的重要细胞[3]。因此在设计疫苗的过程中，需充分考虑如何诱导这些关键细胞。

最后，目前科研人员并不完全清楚黏膜免疫机制，只有对呼吸道黏膜结构及其作用机制了解深入，才能理性开发出合适的呼吸道黏膜疫苗。因为长期处于接触“异物”的一线，黏膜结构多样，细胞组成复杂，拥有特有的IgA 抗体和物理化学屏障。这些都在黏膜免疫保护中起重要作用。因此，不管是固有免疫还是特异性免疫，不管是局部还是全身免疫反应，都值得深入研究，探明其相互关系。

综上，呼吸道黏膜是十分有潜力的疫苗给药途径，亟待合适制剂设计促进其成熟和应用。