US3/US7/US8/UL23/UL50基因缺失重组伪狂犬病病毒的构建及对犬致病性分析

潘玉迪，李 茵，缪 茜，吴 菱，冯 力，田 进

(中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)

伪狂犬病(pseudorabies,PR)，也称为奥耶斯基病(aujeszyk disease,AD)，是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性传染病，可引起新生仔猪的神经脑炎、生长育肥猪的呼吸道症状和母猪的繁殖障碍[1]，也可感染包括猫、兔、牛、羊、犬、水貂、浣熊、狐狸等毛皮动物，并表现出典型的神经系统症状和瘙痒[2]，另外由于PRV的神经毒性是致命的，因此会在几天内死亡[3]。PR不仅给养猪业带来了巨大的经济损失，也给毛皮动物带来了严重的危害。

PRV基因组大小约145 kb，GC含量极高，约为73%[4]。PRV基因组属于D族疱疹病毒基因组，主要由UL区、US区2部分组成，在US区两侧分布着1个内部重复序列(internal repeat sequence,IRS)和1个末端重复序列(ternal repeat sequence,TRS)[1]。PRV有多个毒力相关基因，其中，UL区分布较多，如UL10、UL13、UL21、UL23、UL44和UL50，US区相对较少，如US3、US7、US8[5-7]，在这些毒力相关基因中，US7(gI)、US8(gE)和UL23(TK)被广泛研究，并被认为是在PRV基因缺失疫苗研制中的重要毒力基因。

目前接种疫苗仍是防制和净化PRV的主要策略。在美国和一些欧洲国家使用US8基因缺失疫苗已经很好地控制PRV。自20世纪以来，Bartha-K61株弱毒疫苗在中国得到了广泛的应用，并对PRV提供了有效的保护[8-11]。2011年以来，PRV变异株出现并在全球范围内流行[12]，而经典的商业疫苗并没有对猪感染提供完全有效保护。随后，由该毒株引起的疾病迅速蔓延到了我国22个不同省份，导致许多养殖场猪发生感染。为了控制该病的传播，基于现有的PRV变异株，已开发多种疫苗，包括基于TJ株和HN1201株的US7/US8/UL23基因缺失rPRV[13-15]。

犬、水貂、狐狸等毛皮动物对PRV感染高度敏感。它们通过食用被感染的生猪或禽肉而感染，表现出与PRV感染相似的症状[16]。此外，商品疫苗并未对犬和其他毛皮动物提供安全保护[17]。我国使用的弱毒疫苗在犬体内也具有一定的毒力。LIN等[17]比较2种商业PRV弱毒活疫苗A(Bartha-K61株)和疫苗B(HB98株)对犬的致病性，结果显示PRV弱毒株能够在犬体内水平传播，对犬具有致死作用。研究表明US7/US8/UL23缺失rPRV接种到猪体内并未完全清除，当毛皮动物食用免疫猪的猪肉或内脏时会被US7/US8/UL23缺失rPRV感染，这种疫苗株可能会对毛皮动物显示出较高毒力。本研究基于实验室已有的US7/US8/UL23缺失rPRV，构建US7/US8/UL23/US3/UL50缺失rPRV，并评估了2种缺失弱毒株对犬的致病性。

1 材料与方法

1.1 实验动物16只PRV抗原及抗体均为阴性的健康比格犬。

1.2 主要试剂、毒株和细胞LentiCRISPRv2载体质粒、pcDNA3.1(+)表达质粒、非洲绿猴肾(Vero)细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)和猪肾(PK-15)细胞、抗PRV gE、gI、TK、US3、EP0蛋白多克隆抗体由本实验室保存。病毒DNA提取试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；低熔点琼脂糖(agarose，low-melting temperature)购自Generay Biotech公司；抗鼠 HRP-IgG 抗体购自Sigma公司；SYBR Green qPCR荧光染料购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂盒购自 Roche公司；Esp3Ⅰ内切酶、T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技公司；RIPA 高效裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；PRV GL株于2011年由本实验室从1只狐肺中分离到，并出现严重的神经症状，该病毒在Vero细胞中进行了增殖和滴定。rPRVdelUS7/US8/UL23是在PRV GL的基础上将US7、US8、UL23基因敲除，该基因缺失毒株由本实验室构建并保存。

1.3 病毒基因组提取培养PK-15细胞并传代至20个T75细胞瓶，然后将病毒以10 MOI(100 μL病毒液/瓶)感染剂量接种于细胞中，在CO2培养箱中培养12～16 h后观察细胞病变，及时收毒(注：勿让细胞全部脱落)。将病变细胞收集到50 mL离心管中，4℃ 4 500 r/min离心10 min，弃上清，加入10 mL 细胞裂解液(LCM)重悬细胞，剧烈振荡使所有细胞裂解，冰浴10～15 min。轻缓加入1 mL氟利昂(1,1,2-三氟三氯乙烷)，颠倒混匀5 min，2 500 r/min离心10 min，吸取上清于另一个50 mL离心管中。轻缓加入1 mL氟利昂，颠倒混匀5 min，2 500 r/min 离心10 min，吸取上清于无菌的38 mL超速离心管内。使用注射器将针头插到管的底部，依次向超速离心管内加入12 mL含5%甘油的LCM和含45%甘油的LCM 16 mL。平衡各离心管，28 000 r/min离心2.5 h。小心弃去上清，加入10 mL TEN缓冲液重悬沉淀，充分吹散沉淀(在振荡器上进行)，随后加入500 μL 10% SDS使其终浓度为0.5%，室温作用5 min。加入等体积的平衡酚，轻缓颠倒混匀5 min，10 000 r/min离心15 min，用剪去尖端的枪头吸上层水相于另一灭菌50 mL离心管，加入等体积的酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)抽提3次，10 000 r/min离心15 min。小心吸取上清，加入4.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃过夜。4℃ 10 000 r/min离心15 min，弃上清，风干。沉淀的基因组DNA溶于200 μL 无菌去离子水。测定基因组DNA的浓度和纯度，分装，-80℃保存备用。

1.4 CRISPR/Cas9 sgRNA质粒的构建利用在线CRISPR设计工具(https://zlab.bio/guide-design-resourses)设计了靶向US3、UL50的单向导RNA(sgRNA)(表1)。利用Esp3Ⅰ内切酶酶切LentiCRISPRv2载体质粒，构建CRISPR/Cas9-sgRNA质粒。本研究中所有构建物均经测序验证。

表1 用于靶向病毒相关基因的sgRNA序列

1.5 转移质粒pcDNA3.1-LR-EGFP的构建根据PRV GL株UL区的基因序列，设计引物L-F/L-R、R-F/R-R和pEGFP-C1-F/pEGFP-C1-R(表2)，分别用于扩增UL50基因的左侧同源臂L、右侧同源臂R和目的片段GFP，并引入酶切位点。其中L包括部分UL51基因和部分UL50基因，而R包括了部分UL50基因和全部UL49.5基因(图1)。引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成，引物终浓度稀释成10 μmol/L。

表2 与转移质粒构建相关的引物序列

图1 重组质粒构建示意图

1.6 重组病毒的构建提取rPRVdelUS7/US8/UL23基因组DNA。将Vero细胞接种于6孔板中，12 h后，当细胞90%融合时，用3 μg的rPRVdelUS7/US8/UL23基因组DNA和1 μg的CRISPR-US3-sgRNA1或CRI-SPR-US3-sgRNA2质粒与8 μL的X-treme-GENE HP DNA转染试剂共转染Vero细胞。72 h后收集细胞，于-80℃反复冻融3次。用含1%琼脂糖的MEM覆盖PK-15细胞，通过蚀斑纯化病毒。48 h后，随机挑取纯化克隆，在Vero细胞中进一步繁殖。将PCR鉴定的阳性病毒克隆传代培养20代，检测缺失序列是否恢复，构建US7/US8/UL23/US3基因缺失株，命名为rPRVdelUS7/US8/UL23/US3。将2 μg CRISPR-sgRNA-UL50质粒、2 μg UL50同源臂转移质粒加入到200 μL Opti-MEM中，轻柔混匀后加入8 μL的X-tremeGENE HP DNA转染试剂，轻柔混匀，室温孵育15 min后均匀加入6孔板Vero细胞中，12 h后以1 000 TCID50接种rPRVdelUS7/US8/UL23/US3，48 h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，收集细胞上清并于-80℃反复冻融3次，通过蚀斑纯化纯化病毒，挑取带有荧光的蚀斑克隆，在Vero细胞中进一步繁殖。构建US7/US8/UL23/US3/UL50基因缺失株，命名为rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50。

1.7 PCR鉴定利用病毒核酸DNA/RNA提取试剂盒提取PRV GL、rPRVdelUS7/US8/UL23、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3和rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50基因组DNA，利用Primer Primer 5.0软件设计引物，然后以提取的病毒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化并在吉林省库美生物科技有限公司进行测序鉴定，引物序列如表3所示。

表3 重组病毒鉴定引物

1.8 Western blot检测分别用PRV GL、rPRVdelUS7/US8/UL23和rPRVdelUS7/US8/UL23/US3以MOI为1的剂量接种于6孔板单层Vero细胞，将未感染细胞作为阴性对照，37℃、5% CO2环境下培养24 h后，弃去上清液，每孔加入200 μL RIPA细胞裂解液，室温作用15 min 后将裂解液转移至 1.5 mL 离心管中，加入 50 μL 5×SDS-PAGE Buffer，沸水中煮10 min。按常规方法进行SDS-PAGE，将蛋白转移至NC膜上，在含5%脱脂乳和0.5% Tween 20的TBST中封闭膜1 h，用抗gE、抗gI、抗TK、抗PK、抗 UL50 和抗EP0的多克隆抗体(1∶250)室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤后，用IRDye®800CW山羊抗鼠二抗IgG(1∶15 000)室温孵育1 h。用红外荧光成像系统进行扫膜。小鼠抗gE、抗gI、抗TK、抗PK、抗 UL50和抗EP0多克隆抗体由本实验室制备。用抗Tubulin单克隆抗体检测Tubulin。

1.9 重组病毒多步生长曲线绘制用MDCK、PK-15和Vero细胞进行评价。所有细胞均以2×105个/孔传代于24孔板中，待细胞贴壁后感染PRV GL、rPRVdelUS7/US8/UL23、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3和rPR-VdelUS7/US8/UL23/US3/UL50，感染剂量为MOI=0.1。吸附1 h后换成1% FBS的培养基继续培养，感染后12，24，36，48 h收集上清液。采用Reed-Muench法在Vero细胞上测定TCID50并绘制多步生长曲线。

1.10 重组病毒的致病性试验为了验证rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50的致病性，选取PRV抗体及抗原均为阴性的健康比格犬16只，随机分为4组，每组4只。第1～3组分别通过后腿肌肉注射rPRVdelUS7/US8/UL23、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3或rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50，剂量为2×104TCID50；第4组采用DMEM作为未感染对照。接毒后观察21 d，每天监测临床症状。根据世界动物保护协会提出的犬猫安乐死方法，每组选择2只犬实施安乐死，并采集三叉神经节、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胃组织进行病毒滴度分析。

1.11 实时荧光定量PCR通过荧光定量PCR检测病毒DNA的拷贝数。用UL50正向5′-CCACCAACGGGATCGTGGACGC-3′和UL50反向5′-CGGCGCAAAGACCTCGAAGAAGG-3′为引物，将UL50基因克隆到pJET1.2-blunt/pLB载体中，作为标准品，测定病毒DNA拷贝数。lg拷贝数/g表示每克组织中病毒的拷贝数。

2 结果

2.1 转移质粒pcDNA3.1-LR-EGFP的构建提取PRV GL株病毒基因组DNA，以其为模板经PCR扩增分别得到大小约为745 bp(5′端)和844 bp(3′端)的同源臂片段。将5′端和3′端同源臂片段同时连入pcDNA3.1(+)克隆质粒中，获得重组质粒pcDNA 3.1-LR，通过限制性内切酶酶切后可获得与之对应大小的目的片段(图2B)。以pEGFP-C1表达质粒为模板，PCR扩增得到大小约为1 593 bp的EGFP表达盒片段并插入到重组质粒pcDNA 3.1-LR的2个同源臂之间，获得重组质粒pcDNA 3.1-LR-EGFP，经限制性内切酶酶切后可获得大小约为7 017 bp的载体片段和1 593 bp的EGFP表达盒片段(图2C)，说明质粒连接成功。

M.DL15000 DNA Marker;1.pcDNA3.1-L的酶切片段；2.pcDNA3.1-LR的酶切片段；3.pcDNA3.1-LR-EGFP的酶切片段

2.2 sgRNA介导的基因敲除为了从rPRVdelUS7/US8/UL23基因组中删除US3和UL50基因，设计了针对2个基因的sgRNA(图3A)。提取rPRVdelUS7/US8/UL23基因组DNA，将CRISPR-US3-sgRNA质粒与rPRVdelUS7/US8/UL23基因组DNA共转染72 h后，通过噬斑纯化分离出US3缺失的PRV噬斑。为了鉴定突变株，用US3-F和US3-R引物对其进行扩增并测序验证(图3B)。将缺失US3的rPRV突变体命名为rPRVdelUS7/US8/UL23/US3。为了获得1个缺失US7/US8/UL23/US3/UL50且带有荧光的突变体，将CRISPR-sgRNA-UL50质粒和UL50同源臂转移质粒共转染Vero细胞，12 h后，接种rPRVdelUS7/US8/UL23/US3，接毒后24 h即可观察到明亮的绿色荧光，将细胞上清液接种PK-15细胞，培养24～48 h 后可观察到分散的绿色荧光，6轮蚀斑纯化后，利用UL50-F和UL50-R引物对该突变体进行PCR扩增，重组病毒可得到大小约为2 400 bp的扩增产物，而PRV GL、rPRVdelUS7/US8/UL23、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3得到810 bp左右的扩增产物(图3B)，将该突变体命名为rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50。此外，利用Western blot验证重组病毒的正确性。如图3C所示，PRV GL表达EP0、gE、gI、TK、PK和UL50，rPRVdelUS7/US8/UL23表达EP0、PK和UL50，不表达gE、gI和TK,而rPRVdelUS7/US8/UL23/US3表达EP0和UL50，不表达gE、gI、TK或PK，表明rPRVdelUS7/US8/UL23/US3构建成功。rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50只表达EP0，不表达gE、gI、TK、PK或UL50，表明rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50构建成功。

A.重组病毒构建示意图；B.重组病毒PCR鉴定结果；C.重组病毒Western blot鉴定结果(1.空白对照；2.PRV GL；3.rPRVdelUS7/US8/UL23；4.rPRVdelUS7/US8/UL23/US3；5.rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50)

2.3 重组PRV的生长特性为了比较野生型PRV以及rPRVdelUS7/US8/UL23、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3和rPR-VdelUS7/US8/UL23/US3/UL50突变体的生长动力学，将病毒以MOI=0.1接种Vero、MDCK、PK-15细胞，在不同时间点收集细胞上清液用于病毒滴度测定。如图4A所示，rPRVdelUS7/US8/UL23/US3和rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50在Vero和MDCK细胞中的复制均低于野生型PRV和rPRVdelUS7/US8/UL23，而在PK-15细胞中，4种毒株的生长动力学较为相似。细胞病变分析显示US3、UL50缺失导致rPRVdelUS7/US8/UL23/US3、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50感染Vero和MDCK细胞缺乏细胞融合(图4B)。

A.重组病毒在Vero、PK-15、MDCK细胞中的复制动力学；B.重组病毒在Vero、PK-15、MDCK细胞中的病变分析

2.4 重组PRV毒株在犬体内的致病性为比较rPRVdelUS7/US8/UL23、rPRVdelUS7/US8/UL23/US3和rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50突变株在2月龄比格犬体内的致病性，将2×102TCID50/500 μL病毒注射右后肢肌肉中。存活率分析显示，rPRVdelUS7/US8/UL23感染组犬均于感染3 d后死亡，rPRVdelUS7/US8/UL23/US3感染组在感染15 d时死亡1只，rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50感染组在感染后21 d内未引起死亡(图5A)。在感染过程中，观察临床症状，空白对照组未观察到临床症状，rPRVdelUS7/US8/UL23组攻毒犬全部出现食欲下降、共济失调和右后肢瘫痪；rPRVdelUS7/US8/UL23/US3感染组1只犬11 d开始出现精神萎靡，食欲下降的症状，而rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50攻毒组所有犬没有观察到典型临床症状。表明缺失US3、UL50基因后的rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50重组病毒毒力明显下降。接毒4 d后，每组取2只动物处死，取三叉神经节、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胃进行组织病毒载量分析。采用qRT-PCR监测不同组织的病毒载量。然而，3种重组病毒均仅在三叉神经节中检测到病毒，且病毒载量没有明显差异(图5B)。

A.攻毒后21 d内犬的存活情况；B.病毒基因组在不同组织中的基因组拷贝数

3 讨论

PR是一种急性传染病，可发生在多种家畜和野生动物身上。动物感染后可表现为发热、脑脊髓炎、呼吸紊乱和神经功能障碍。猪是PRV的主要天然宿主。PRV在猪群中的流行病学和致病性研究已有很多；相比之下，关于毛皮动物感染PRV以及PRV基因在毛皮动物体内毒力的报道很少。犬、水貂、狐狸等毛皮动物对PRV感染高度敏感。他们食用经US7/US8弱毒疫苗免疫猪的生杂碎可导致类似于PRV感染的症状[16]。我国报道的弱毒疫苗对犬有毒力作用。研究表明，PRV弱毒株能够在犬体内水平传播，对犬具有致死性[17]。2011年以来，为了阻止PR的传播，基于流行变异株的US7/US8/UL23缺失rPRV疫苗被研发出来，该疫苗对猪有很好的免疫保护作用，但犬由于食用受污染的生肉或接触免疫猪而日益受到PRV的感染。据推测，US7/US8/UL23缺失的rPRV没有完全清除，食用免疫猪肉或接触粪便的毛皮动物也会感染。为了证实这一假设，本实验室基于从狐狸分离到的PRV GL株构建了一个US7/US8/UL23缺失的rPRV，用该毒株感染犬后验证US7/US8/UL23缺失的rPRV的毒力与野生型病毒相当，进一步支持了现有的减毒疫苗对毛皮动物不安全。本研究基于rPRVdelUS7/US8/UL23制备了US7/US8/UL23/US3/UL50缺失的rPRV，证明rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50在犬体内毒力显著降低。

rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50与rPRVdelUS7/US8/UL23相比，复制延迟，滴度降低。CPE观察显示，PRV GL株和rPRVdelUS7/US8/UL23感染细胞形成细胞膜融合，而rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50感染细胞则没有。PRV编码许多不同的包膜糖蛋白，gB、gD、gH和gL是病毒膜融合蛋白[18]。缺乏糖蛋白gB、gD、gH或gL的病毒突变体无法穿透靶细胞[19]。US3不仅在病毒在易感细胞的传播中起重要作用，而且当其在细胞核内定位于足够数量时，会引发肌动蛋白应激纤维的断裂[20]。此外，HSV-1 US3是一种多功能蛋白，可以通过磷酸化多种病毒和细胞底物来调节病毒的复制[21]。US3缺失可能导致某些病毒蛋白，特别是病毒糖蛋白缺乏磷酸化。US3的两种功能都可能影响感染时的细胞融合。本课题组前期研究发现，FHV-1 US3缺失显著降低了三叉神经节的毒力并阻断了三叉神经节的侵袭[22]。UL50具有dUTPase活性，dUTPase催化dUTP水解为dUMP和无机焦磷酸盐，并为dTTP生物合成提供dUMP前体；此外，dUTPase保持较低的细胞dUTP/dTTP比率，以防止尿嘧啶部分掺入DNA。因此，这种蛋白对于DNA复制和基因组稳定性至关重要[23]。研究表明，PRV UL50表达后，通过溶酶体途径诱导IFNAR1的降解，对Ⅰ型IFN信号通路具有强的抑制作用，另外使IFN诱导的STAT1磷酸化及入核显著下降，以此促进病毒感染和逃逸宿主天然免疫，因此UL50可作为潜在的抗病毒靶标[24]。本研究发现在rPRVdelUS7/US8/UL23背景下敲除US3、UL50降低了对犬的病毒毒力。经rPRVdelUS7/US8/UL23/US3/UL50攻毒后，所有犬均保持健康状态，无发热、神经性疾病和呼吸困难。相比之下，rPRVdelUS7/US8/UL23感染组出现明显的临床体征，所有犬均于4 d内死亡。最近的一项研究报道，在第4天时，将Bartha-K61以1×105TCID50接种犬后没有死亡，也没有出现任何典型的症状[17]，但所有犬在28 d内死亡。虽然缺失PRV GL的US7、US8和UL23基因，但rPRVdelUS7/US8/UL23仍保持高毒力。这些结果表明PRV GL变异株比经典毒株毒力更强。

虽然US7/US8/UL23缺失的PRV可以保护猪免受野生型PRV的感染，但对犬和其他毛皮动物来说是一大威胁。有必要研制一种更安全的疫苗，以防止犬被PRV弱毒疫苗株感染。本研究采用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术制备US7/US8/UL23/US3/UL50缺失的PRV变异体，并对其在犬体内的致病性进行了评价。试验发现在缺失US3、UL50 rPRVdelUS7/US8/UL23犬的毒力降低，提示US3、UL50在犬PRV的发病过程中是必需的，在研制更安全的PRV疫苗时应予以考虑。