猪圆环病毒2，3，4型三重荧光定量PCR检测方法的建立和应用

谢荣辉，王雅婷，安慧婷，黄 靖，张红丽，刘 霞，冯肖肖，陈伟良，董建斐，张 璐，徐 辉，赵灵燕

(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 310018)

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)为无囊膜、单链环状DNA病毒，属于环状病毒科环状病毒属成员[1]。目前PCV包括猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCV1)、2型(PCV2)、3型(PCV3)和4型(PCV4)4个血清型别,其中PCV1对猪无致病性[2]。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、繁殖障碍、呼吸道疾病综合征及皮炎肾病综合征等[3]。PCV3可引起猪只心脏和多系统炎症、皮炎肾病综合征、仔猪消瘦、腹泻及母猪繁殖障碍等[4-5]。PCV4感染可引起猪只呼吸道和肠炎症状及皮炎肾病综合征等[5-6]。目前各种型别PCV在我国均有存在，且部分猪只存在着不同型别PCV共感染现象[7-11]。由于PCV2、PCV3和PCV4引起的临床症状非常相似，因此需建立一种快速、敏感及特异的检测方法来区分各种型别PCV和其他病毒的感染。荧光定量PCR检测技术具有快速和灵敏等优点，已广泛应用于人类和动物传染病病原体检测中。本研究旨在建立一种同时可检测PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定量PCR检测方法，为PCV的诊断和防控研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品和病毒株猪口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)灭活疫苗、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)活疫苗、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)灭活疫苗及猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)疫苗为中牧实业股份有限公司产品；PCV2灭活疫苗为浙江诗华诺倍威生物技术有限公司产品。以上疫苗经核酸提取核酸后均可获得相应病毒核酸。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)由本实验室分离保存；猪伪犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、PCV3、PCV4和PCV1病毒核酸含量高的阳性样品经鉴定后由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器pGEM-T Easy Vector Systems 购自Promega公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒抽提试剂盒Mini BEST Plasmid Purification Kit、DNA凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、Ex Taq酶、DL2000 DNA Marker、DH5α感觉态细胞和X-gal均为大连宝生物工程有限公司产品；QuantiNova Multiplex PCR Kit为Qiagen公司；病毒核酸提取试剂盒MagNA pure 96 DNA and viral NA Small Voume Kit为Roche公司产品。荧光定量PCR仪(型号Lightcycler480)为Roche公司产品；PCR仪(型号TProfessional)为德国Biometra公司产品；冷冻高速离心机(型号5430R)为Eppendorf产品；超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000)为Thermo公司产品。

1.3 引物的设计与合成根据GenBank中PCV2、PCV3和PCV4的保守序列设计引物和探针(表1)。引物和探针均由生工生物(上海)工程有限公司合成并标记。

表1 PCR检测所用引物和探针

1.4 病毒核酸的提取用病毒核酸提取试剂盒MagNA pure 96 DNA and viral NA Small Voume Kit按照仪器操作说明书方法提取病毒核酸，将获得的病毒核酸保存于-80℃冰箱中备用。

1.5 PCV2、PCV3和PCV4重组质粒的制备根据GenBank中PCV2、PCV3和PCV4基因序列，设计合成引物(表2)分别扩增含PCV2、PCV3和PCV4荧光定量PCR检测基因的核酸片段，具体操作如下：分别以上述病毒核酸为模板进行PCR反应，反应体系50 μL：10×Ex Taq Buffer 5 μL,dNTP 4 μL,Ex Taq(5 U/μL)0.25 μL，上游引物P1(20 μmol/L)1 μL，下游引物P2(20 μmol/L)1 μL，模板 5 μL，无RNA酶水 33.75 μL。反应条件：95℃ 2 min；98℃ 10 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min。将扩增的目的片段回收后克隆于pGEM-T Easy载体中构建含目的基因的重组质粒，构建的重组质粒分别命名为T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4，并送上海生工生物工程技术有限公司进行测序鉴定。利用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，并计算拷贝数。

表2 PCV2、PCV3和PCV4荧光定量PCR检测引物

1.6 反应体系优化以重组质粒为检测模板，利用矩阵法对探针和引物浓度进行优化。

1.7 特异性试验利用所建立的荧光定量PCR方法对PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、CSFV、PEDV、TGEV、FMDV、PPV、PRRSV和PRV核酸进行检测，同时设阴性对照，评价方法的特异性。

1.8 PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定PCR检测方法敏感性评价和病毒标准曲线的建立分别将重组质粒T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4作10倍倍比稀释，采用本研究所建立的荧光定量PCR方法进行检测，确定最低检出模板拷贝浓度。并对检测结果以反应体系中重组质粒终浓度的对数和Ct值分别为x轴和y轴绘制标准曲线。

1.9 重复性试验分别以反应体系中终浓度为106,105,104,103和102拷贝/μL的重组质粒T-PCV2、T-PCV3和T-PCV4为模板，利用所建立的荧光定量PCR方法进行检测，每个稀释度的同一模板均进行4次批内和批间重复试验，并计算批内及批间的平均值、方差及变异系数。

1.10 临床样品检测猪组织样品用PBS稀释研磨，离心后取上清，提取病毒核酸，利用所建立的荧光定量PCR和普通单重PCR方法(扩增引物见表3)[5,8-9]对采自浙江省部分地区的83份猪组织样品进行检测。

表3 PCV2、PCV3和PCV4普通单重PCR检测引物

2 结果

2.1 反应体系优化采用矩阵法对引物和探针浓度进行优化，PCV2、PCV3和PCV4引物在反应体系中的最佳终浓度分别为0.4,0.4,0.6 μmol/L，PCV2、PCV3和PCV4探针在反应体系中的最佳终浓度分别为0.25,0.25,0.4 μmol/L。反应条件为：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环；60℃收集荧光。

2.2 特异性试验对PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、CSFV、PEDV、TGEV、FMDV、PPV、PRRSV和PRV的检测结果显示，PCV2、PCV3、PCV4分别在波长618～660，533～580,455～510区间出现了扩增曲线(图1)。而其他病毒核酸和阴性对照在这3个波长区间均无扩增曲线出现，表明建立的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定量PCR检测方法与PCV1、CSFV、PEDV、TGEV、FMDV、PPV、PRRSV和PRV无交叉反应，且PCV2、PCV3和PCV4之间无交叉反应,具有良好的特异性。

1.PCV2；2.PPV；3.CSFV；4.PRRSV；5.PCV1；6.PRV；7.FMDV；8.PEDV；9.TGEV；10.PCV3；11.PCV4；12.阴性对照

2.3 标准曲线的建立和敏感性评价以不同稀释度的重组质粒(T-PCV2、T-PCV3、T-PCV4)为模板进行荧光定量PCR扩增，得出扩增曲线(图2)，并建立荧光定量PCR标准曲线(图3)。结果显示，PCV2、PCV3和PCV4荧光定量PCR标准曲线相关系数R2分别为0.995 9，0.992 8,0.995 8，都具有良好的线性关系。敏感性试验结果表明，PCV2、PCV3最低检测值均为10 拷贝/μL。而PCV4最低检测值为1 拷贝/μL。

1.106拷贝/μL；2.105拷贝/μL；3.104拷贝/μL；4.103拷贝/μL；5.102拷贝/μL；6.10拷贝/μL；7.1拷贝/μL；8.10-1拷贝/μL；9.阴性对照

图3 PCV2(A)、PCV3(B)、PCV4(C)扩增标准曲线

2.4 重复性试验分别以反应体系中终浓度为106，105，104，103，102拷贝/μL的重组质粒(T-PCV2、T-PCV3、T-PCV4)为模板，对每个稀释度的模板分别进行4次批内和批间重复检测，结果显示同一模板不同浓度的批内和批间变异系数均在3%以内，表明所建的荧光定量PCR方法具有良好的重复性和稳定性(表4)。

表4 PCV2、PCV3、PCV4三重荧光定量PCR方法重复性试验

2.5 临床应用评价分别利用本研究建立的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定量PCR检测方法、PCV2普通PCR检测方法、PCV3普通PCR检测方法和PCV4普通PCR检测方法对83份猪组织样品进行检测，检测结果显示建立的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定量PCR检测方法与PCV2、PCV3和PCV4单重PCR检测方法阳性符合率分别为100%，95.82%，94.51%，具有较高的一致性，准确率较高(表5)。

表5 PCRV2、PCRV3、PCRV4三重荧光定量PCR与普通PCR方法检测临床样品结果(n=83)

3 讨论

近年来，PCV新的型别被不断发现，2016年首次报道在猪皮炎和肾综合征中检出PCV3[12]，2019年我国学者在湖南患病猪中检出PCV4[6]。研究表明PCV2已在世界范围内流行，给养猪业带来了巨大的经济损失[13-14]；PCV3在中国、美国、波兰，巴西、西班牙、意大利和瑞典等国家被报道存在并致病[8,10,12,15-18]；PCV4目前也已在我国多个省份存在并流行[2,6,19-21]。多种型别PCV的流行和共同存在，给该类疫病的检测和监测造成了巨大困难，虽然目前国内外学者已建立了PCR、荧光定量PCR及数字PCR方法等核酸检测方法应用于PCV的检测，但大部分只针对1或2种以内PCV，为了更加准确、快速地检测各种PCV，本研究建立了基于TaqMan探针的PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定量PCR检测方法，该检测方法可同时对PCV2、PCV3和PCV4进行检测，对PCV2、PCV3和PCV4检测下限分别10,10，1 拷贝/μL，具有较高的灵敏度，优于以前报道的PCR方法和荧光定量PCR检测方法，且具有通量高、快速和操作简便等优点。临床样品检测结果表明PCV2、PCV3和PCV4三重荧光定量PCR检测方法与单重PCR检测方法具有高度的一致性，可应用于临床样品的检测。

利用建立的三重荧光定量PCR检测方法对采自浙江省部分地区的83份组织样品进行检测，结果显示PCV2、PCV3和PCV4单一病毒感染的样品阳性率分别为68.67%，27.71%和20.48%，PCV2和PCV3共同感染的样品阳性率为26.51%，PCV2和PCV4共同感染的阳性率为19.28%，PCV3和PCV4共同感染的样品阳性率为6.02%，PCV2、PCV3和PCV4这3种病毒共同感染的样品阳性率为6.02%。此结果表明浙江省部分地区各种型别PCV在猪群中具有较高的感染率，且存在着不同型别PCV共同感染的现象，这与国内前期报道一致。