保产无忧散对孕晚期大鼠Cx-43基因表达及宫颈成熟相关指标的影响

亢雪峰,马 兰,钟伟兰,戴卫波,林 慧,黄淑媛

(1.广州中医药大学附属中山医院妇产科,广东 中山 528400;2.广州中医药大学附属中山医院药理实验室，广东 中山 528400)

宫颈成熟度是引产成功的关键，也是分娩发动的一个必要条件[1]。如果处理欠妥，将会使难产率大大增加，有可能危及母婴生命。保产无忧散首见于《傅青主女科》，且多本医书均有记载，有“未产能安，临产能催”的神效[2]。以往报道显示[3]，保产无忧散可以促妊娠足月孕妇宮颈成熟，减少宮缩乏力的发生，缩短第一产程，并可降低剖宫产率。但其具体作用机制尚未明确，已有临床研究显示，缝隙连接蛋白43(Connexin-43，Cx-43)的表达升高可增强妊娠晚期子宫肌层缝隙连接功能，进而促使子宫前列腺素 E2(Prostaglandin，PEG2)、宫颈白介素-8(Interleukin-8，IL-8)以及宫颈基质金属蛋白酶 9(Matrix meytallopeptidase-9，MMP-9)的表达，发挥促进宫颈成熟作用[4-5]。本研究结合前期研究，采用“保产无忧散”处方干预的方法，通过对孕晚期大鼠子宫 Cx-43 基因及蛋白表达的测定及对宫颈成熟相关指标PEG2、IL-8及MMP-9的表达测定，以探讨保产无忧散促进宫颈成熟的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选择SPF级雌性SD大鼠，体重300～350 g。购买时除空白对照组(未孕鼠)外，其余雌鼠均为受孕第10天。大鼠由珠海百试验通生物科技有限公司提供，许可证号SYXK(粤)2020-0109。

1.1.2 动物饲养及分组：孕鼠每笼1只单独喂养，饲养于中山市中医院中药药理实验室，屏障级环境，12 h光照和黑夜循环，隔日换垫料，专室饲养，专人负责。标准饲料，自由饮水，实验时将妊娠SD大鼠随机分为三组，分别为模型对照组、保产无忧散低剂量给药组(低剂量给药组)与保产无忧散高剂量给药组(高剂量给药组)。

1.1.3 药物：保产无忧散组方为当归、荆芥炭、川芎、艾叶、枳壳、炙黄芪、莬丝子、厚朴、羌活、川贝母、白芍、生姜、甘草各5 g。

1.1.4 主要仪器：Multiskan FC型全波长酶标仪(美国ThermoFisher公司)；2-16R高速冷冻离心机(湖南恒诺设备仪器有限公司)；F6/10超细匀浆器(德国FLUKO公司)。

1.1.5 主要试剂：BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，由上海碧云天生物技术有限公司提供；大鼠Cx-43 ELISA试剂盒，由天津安诺瑞康生物技术有限公司提供，批号：225-P01。

1.2 实验方法

1.2.1 药物煎煮：称取以上13味药物，加水共煎煮2次。第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，合并两次煎液，滤过。根据实验动物与人体表面积比，将人日用药量换算成大鼠的剂量，将药液浓缩为含生药1.17 g/ml，即相当于人临床常用量的2倍剂量，作为高剂量组给药量；倍比稀释成含生药0.585 g/ml，相当于人临床常用量的1倍剂量，作为低剂量组给药量。4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 动物分组：取受孕成功的孕鼠30只，采用随机法将孕鼠分成模型对照组、低剂量给药组、高剂量给药组三组，每组各10只。另取11只未孕鼠作为正常对照组。

1.2.3 动物给药方法：适应性喂养5 d后，保产无忧散低、高剂量给药组孕鼠于妊娠第16天开始给药，1次/d，均按1 ml/100 g体重灌胃给药。模型对照组(孕鼠)、空白对照组(未孕鼠)均予以蒸馏水灌胃，所有动物连续灌胃5 d，每天观察及称体重1次。于孕鼠妊娠第20天，给药后2 h，采用颈椎脱臼处死大鼠，冰上解剖取子宫，在冰上分离宫体及宫颈，剔除宫颈外围疏松组织及剥离胎儿及胎儿附属组织，将子宫分为子宫体、子宫颈两部分。

1.2.4 标本采集及观察指标

1.2.4.1 子宫组织处理方法：取子宫组织50～500 mg，置于玻璃匀浆试管中，加入预冷的0.86%氯化钠水溶液(450～4500 ml)，一手握住匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，一手持捣杆垂直插入套管中，充分研碎子宫组织，使其匀浆化，最后将制备好的10%匀浆(4000 r/min)离心15 min，取上清液备用。

1.2.4.2 子宫体Cx-43含量测定：取一部分子宫体经液氮降温后放置在-20 ℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定Cx-43的表达，参照试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠子宫体Cx-43含量。

1.2.4.3 子宫体Cx-43免疫组化检测：取一部分子宫体用福尔马林液固定，标本制成石蜡块，免疫组化检测Cx-43的表达，由武汉赛维尔生物科技有限公司提供技术支持。应用组织切片数字扫描系统采集免疫组化切片上的图像，利用赛维尔图像分析系统自动读取组织测量区域，先进行阳性等级划分。0分：阴性无着色；1分：弱阳性淡黄色；2分：中阳性棕黄色；3分：强阳性棕褐色。采用Histochemistry score(H-score，免疫组织化学评分)评分法[6]，将每张切片内阳性数量及其染色强度转化为相应的数值，取其均值，间接反映其表达强度。H-score数值0～300，数值越大表示Cx-43综合阳性越强。

1.2.4.4 大鼠子宫组织PEG2、IL-8、MMP-9水平：采用ELISA测定子宫前列腺素 E2(PEG2)、宫颈白介素-8(IL-8)以及宫颈基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1 (TIMP-1)水平，测定方法严格按照试剂盒说明书操作程序操作。试剂盒均购于厦门慧嘉生物科技有限公司。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，免疫组化标本采用图像分析软件Image-Pro Plus 进行图像灰度值的半定量分析；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 保产无忧散对孕晚期大鼠子宫体Cx-43含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组、低剂量组及高剂量给药组子宫Cx-43表达均显著升高(t=-8.593,-12.374,-8.627，均P<0.001)，与模型对照组比较，低剂量给药组Cx-43表达升高(t=-2.883,P=0.005)，高剂量给药组表达下降，差异无统计学意义(t=1.147，P=0.133)，见表1。

表1 保产无忧散对孕晚期大鼠子宫体Cx-43含量的影响(ng/ml)

2.2 保产无忧散对孕晚期大鼠子宫平滑肌中Cx-43阳性表达强度的影响 与正常对照组比较，模型对照组、低剂量给药组及高剂量给药组子宫平滑肌中Cx-43阳性表达强度均显著升高(t=-3.256,-5.572,-3.642，P=0.002,<0.001,<0.001)，与模型对照组比较，低剂量给药组Cx-43阳性表达强度升高(t=-1.950，P=0.033)，高剂量给药组表达升高，但差异无统计学意义(t=-0.653，P=0.261)，见表2(图1)。

表2 保产无忧散对孕晚期大鼠子宫平滑肌中Cx-43阳性表达的影响(分)

图1 Cx-43免疫组化染色结果(HE染色，×200)

2.3 保产无忧散对孕晚期大鼠子宫组织PEG2、IL-8、MMP-9及TIMP-1水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组、低剂量给药组、高剂量给药组子宫组织中PEG2、IL-8、MMP-9、TIMP-1水平均显著升高(PEG2：t=-3.423,-6.004,-5.079，P=0.001,<0.001,<0.001； IL-8：t=-6.097,-7.995,-5.430，均P<0.0011;MMP-9：t=-3.619,-6.172,-4.529，均P<0.001;TIMP-1:t=-2.522,-10.938,-10.938，P=0.011,<0.001,<0.001)，与模型对照组比较，低剂量给药组子宫组织中PEG2、IL-8、MMP-9水平均升高(t=-2.157,-3.163,-2.671,-6.912，P=0.022,0.003,0.008,<0.001)，高剂量给药组子宫组织中PEG2、IL-8、MMP-9水平均升高，但差异无统计学意义(t=-1.304,-0.567,-1.189,-1.610，P=0.104,0.289,0.125,0.062)，见表3。

表3 保产无忧散对孕晚期大鼠子宫组织PEG2、IL-8、MMP-9及TIMP-1水平的影响

3 讨 论

各种原因引起胎儿生长受限、羊水过少、过期妊娠等仍是严重威害产妇及新生儿安全的关键因素，针对上述情况需要进行主动促分娩措施，不然则会增加围生儿及产妇病死率[7-9]。引产是临床主要的促分娩措施，宫颈成熟度是引产成功的重中之重，也是分娩发动的前提条件[10-12]。传统中医理论认为补气养血、引胎下行是催生下胎之大法[13-15]。基础研究显示，补气养血类中药具有软化子宫管、促进宫颈胶原蛋白疏松和降解的作用，同时提高子宫平滑肌的兴奋性。郑丹如等[16]报道显示，改善孕妇气血两虚证有利于促进足月孕妇宫颈成熟。保产无忧散见于《傅青主女科》，有“未产能安，临产能催”的神效，普遍流传于民间，以防治难产。方中川芎、当归、芍药可活血化瘀，厚朴、枳壳、羌活可行气，荆芥、艾叶可温行气血，黄芪可益气，菟丝子可护胎，全方共奏活血化瘀，益气护胎之效，使血气流畅，机体充沛，有利于促进分娩，降低难产发生率。前期临床研究显示[3]，保产无忧散能有效地促宫颈成熟，缩短第一产程，降低剖宫产率。

子宫收缩是分娩发动及胎儿顺利娩出的关键环节，而子宫收缩的前提是各种蛋白、分子等共同作用的结果，其中Cx-43蛋白在子宫收缩中起到关键性作用[2]。分娩启动子宫平滑肌收缩时，Cx-43快速上升，并在其动作电位的产生中提供了低电阻位点，使电冲动传至整个子宫肌层诱发分娩，同时促使分娩时子宫肌同步收缩[17]。本研究发现，模型对照组子宫体Cx-43的含量、子宫平滑肌中Cx-43阳性表达强度与正常对照组比较显著提高，低剂量给药组子宫体Cx-43的含量、子宫平滑肌中Cx-43阳性表达强度与模型对照组比较显著升高，但高剂量给药组子宫体Cx-43的含量、子宫平滑肌中Cx-43阳性表达强度与模型对照组比较差异无统计学意义，提示低剂量保产无忧散可通过刺激Cx-43表达发挥促宫颈成熟的作用。

研究发现[18]，PEG2可以促进子宫平滑肌收缩，增强子宫平滑肌收缩效应，尤其是在分娩进程中可以刺激催产素诱发的宫缩效果，进而促进分娩。IL-8是与妊娠存在紧密联系的趋化因子之一[19]。妊娠末期趋化因子刺激宫颈组织中白细胞表达上升，基质金属蛋白酶类(MMPs)受到趋化因子的刺激释放增加，MMP-9是MMPs的主要成员，底物为胶原纤维，是宫颈结缔组织中的重要成分，在MMP-9表达增加的前提下可导致胶原纤维破坏，致使宫颈支持结构遭到破坏，诱发子宫颈变软、舒张，促进宫颈成熟[20]。而TIMP-1对MMP-9有调控作用，二者保持动态平衡以保证正常的宫颈成熟和扩张。本研究发现，模型对照组PEG2、MMP-9和IL-8的含量与正常对照组比较明显升高，低剂量给药组PEG2、MMP-9和IL-8的含量与模型对照组比较显著升高，高剂量给药组子宫组织中PEG2、IL-8、MMP-9水平均升高，但差异无统计学意义，提示低剂量保产无忧散可促进妊娠晚期大鼠子宫收缩，促进大鼠分娩，可能是通过促进PEG2、MMP-9和IL-8合成和分泌而实现。

综上所述，低剂量保产无忧散通过提高孕晚期大鼠子宫组织中Cx-43的表达及PEG2、MMP-9和IL-8含量，促进宫颈成熟。本研究从分子生物学的角度明确了保产无忧散促进大鼠宫颈成熟的作用机制，为临床上保产无忧散辅助自然分娩的应用提供了科学参考，但本研究未发现保产无忧散呈剂量依赖性。