绿萝花黄酮对糖尿病周围神经病变小鼠运动神经传导速度及NF-κB信号通路的影响

陈明霞，马 雪，陈佩文，冷 伟

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常见的并发症之一，表现为远端神经的感觉和运动神经障碍，治疗上在控制血糖同时以营养神经和改善微循环为主[1-2]。DPN的病因复杂，普遍认为是由于慢性高血糖、氧化应激等引起缺血缺氧，破坏微血管进而导致内皮功能障碍，最终出现周围神经节段性脱髓鞘和轴突萎缩，引发周围神经功能障碍[3-4]。因此，改善DPN运动、感觉障碍是当前治疗DPN的临床目标。中医认为DPN属“消渴”“痹症”等范畴，以气血阴阳亏虚为本，痰浊瘀血阻滞经络为标，中药治疗对于改善DPN具有一定疗效[5]。近年来，中药的活性成分因其丰富的药理作用和较少的不良反应一直成为DPN药物开发的热门，其中黄酮类化合物更是受到广泛关注，儿茶素和木犀草素均对DPN中坐骨神经传导速度具有较好的改善作用，黄芩素具有改善热痛觉减退的作用[6]。藏药绿萝花中含有多种活性成分，包括黄酮类、香豆素等，对糖尿病、心血管疾病以及癌症等均具有一定的治疗作用[7]。Zhang等[8]发现绿萝花水提物可改善棕榈酸诱导HepG2肝细胞产生的胰岛素抵抗。王洁雪等[9]也发现绿萝花中的绿萝花苷等化合物可抑制α-葡萄糖苷酶活化。基于以上证据研究组推测绿萝花总黄酮对DPN具有治疗作用。本研究以DPN小鼠为研究对象，探讨绿萝花对其运动、感觉障碍的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：90只SPF级C57BL/6雄性小鼠，6周龄，体重18～22 g，3只SPF级C57BL/6乳鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK(京)2021-0006。动物饲养温度湿度适宜，自由饮食，实验经伦理委员会批准，符合实验动物3R原则。

1.1.2 药品与试剂：绿萝花总黄酮(陕西森元生物科技有限公司)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(北京索莱宝科技有限公司)，RIPA裂解液、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin 1β，IL-1β)小鼠ELISA检测试剂盒、Trizol(武汉博士德生物工程有限公司)，核转录因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)p65、kappa B抑制因子激酶β(Inhibitor of kappa B kinase β,IKKβ)、IKKα、p-IKKβ、p-IKKα抗体(Abcam公司)，PCR引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)，PCR试剂盒(Takara公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、造模和干预：将90只C57BL/6小鼠用普通饲料适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组10只和高脂高糖组80只，空白组小鼠给予普通饲料，高脂高糖组小鼠换为高脂饲料饲养5周，除空白组外其余小鼠均按照文献[10]复制DPN小鼠模型，造模前禁食12 h，腹腔注射1% STZ柠檬酸盐缓冲溶液(100 mg/kg)，空白组腹腔注射等体积柠檬酸盐缓冲溶液，72 h后对小鼠进行禁食12 h，检测尾静脉血糖，若血糖>16.7 mmol/L即为造模成功。将造模成功的65只小鼠随机按随机数字表法分为模型组、阿卡波糖组和绿萝花总黄酮高、中、低剂量组各13只，第2 天开始药物干预，期间除空白组外其余组小鼠仍给予高脂饲料，空白组给予普通饲料，阿卡波糖组以阿卡波糖150 mg/kg灌胃，绿萝花总黄酮高、中、低剂量组分别给予绿萝花总黄酮200、100、50 mg/kg灌胃，空白组和模型组予以等体积0.9%氯化钠水溶液灌胃，1次/d，持续40 d。分别在治疗第10、20、40天时每组随机选5只小鼠测体重及血糖指标、运动神经传导速度(MNCV)、血清炎症因子水平、坐骨神经组织病理学、坐骨神经NF-κB信号通路蛋白表达水平。

1.2.2 MNCV和热痛反应敏感程度测定：将小鼠固定在热痛测定仪塑料筒内适应20 min，光热刺激小鼠尾部，记录光热刺激开始到甩尾间所用的时间即为热痛反应时间。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)，剪开股二头肌与半膜肌间皮肤，暴露坐骨神经，测量MNCV时将刺激电极插入小鼠右侧坐骨切迹，记录电极分别插入小鼠踝部和左足底第2趾间，测量感觉神经传导速度(SNCV)时将刺激电极置于同侧足背，记录电极放置在近端坐骨切迹处，用Power Lab生理记录仪记录复合动作电位，从开始刺激到诱发电位出现的时间为潜伏期。MNCV=两记录电极间距离/潜伏期之差，SNCV=刺激电极与记录电极间距离/潜伏期。

1.2.3 ELISA检测炎症因子水平：运动神经传导速度和热痛反应敏感程度测定后进行心脏采血，静置2 h后6000 r/min离心15 min分离血清，采用ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-1β含量。预包被抗原的96孔板中加入血清稀释液和HRP酶标抗体，室温震荡孵育60 min，洗板后甩去多余液体，按照试剂盒说明书要求加入显色液后避光反应20 min，加入终止液终止反应，立即用酶标仪测定波长450 nm处吸光度。样本浓度=(样本吸光度/标准品吸光度)×标准品浓度。

1.2.4 HE染色观察病理学改变：小鼠处死后在无菌操作台上分离坐骨神经，一部分用10%中性福尔马林固定48 h，一部分保存于-80 ℃冰箱中用于后续检测。将坐骨神经条经梯度乙醇脱水、石蜡包埋处理，然后在切片机上将石蜡块切成厚度约4 μm的薄片，再经切片脱蜡、苏木素-伊红染色、脱水、透明、封片等步骤，用光学显微镜观察坐骨神经形态学的变化。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达水平：坐骨神经组织加入RIPA裂解液匀浆后，低温高速离心30 min，取上清液，测定蛋白浓度并定量，水浴变性。配制10%分离胶和5%浓缩胶，上样后以80 V初始电压进行电泳，Maker下至分离胶上缘后将电压转至100 V，继续电泳Maker位于分离胶下缘，以恒流30 mA电转60 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育分别孵育一抗(1∶500)过夜，室温孵育二抗(1∶5000)1 h后显色，以GAPDH为内参，用Image J软件进行灰度分析。

1.2.6 RT-qPCR检测mRNA相对表达量：Trizol法提取坐骨神经总RNA并逆转录为cDNA，RT-qPCR检测目的基因mRNA相对表达量，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，循环40次；72 ℃延伸10 min。以GAPDH为内参，计算2-△△Ct即为mRNA相对表达量，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.7 乳鼠坐骨神经施万细胞原代培养与干预：脱颈处死乳鼠，75%乙醇消毒，无菌操作台上分离坐骨神经，置于含D-Hank’s液的培养皿中剥离神经外膜和束膜后将组织剪碎，加入工作培养基浸没组织，接种于培养瓶中，常规培养、传代。取第3代增殖良好的施万细胞换为含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素DMEM高糖培养基，37 ℃、5% CO2培养至对数生长期用于实验。将施万细胞分为正常组、LPS组、LPS+阿卡波糖组、LPS+绿萝花总黄酮高、中、低剂量组，接种于96孔板中培养过夜(1×105/ml)，细胞贴壁后开始干预，LPS组加入LPS(1 μg/ml)，LPS+阿卡波糖组同时加入阿卡波糖(40 μg/ml)和LPS，LPS+绿萝花总黄酮高、中、低剂量组分别同时加入绿萝花总黄酮(80、40、20 μg/ml)和LPS，正常组加入等体积DMEM培养基，分别在12、24、48 h后用ELISA试剂盒检测细胞上清液中TNF-α、IL-6分泌情况，Western blot检测NF-κB p65、IKKβ、IKKα、p-IKKβ、p-IKKα蛋白表达，RT-PCR检测NF-κB、IKKβ、IKKα、NF-κB p65的mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1 绿萝花黄酮对DPN小鼠体重和血糖水平影响 造模后，血糖<16.7 mmol/L而未成功造模的小鼠有15只，其中有6只死亡，治疗期间均无动物死亡，造模成功率为81.25%，动物病死率为6.70%。治疗40 d期间，空白组和绿萝花黄酮低剂量组小鼠体重血糖水平变化比较差异无统计学意义(P>0.05)，模型组小鼠体重逐渐降低(P<0.05)，血糖水平逐渐升高(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠体重逐渐升高(P<0.05)，血糖水平逐渐降低(P<0.05)；治疗第10天，与空白组比较，模型组小鼠体重显著降低(P<0.05)，血糖水平显著升高(P<0.05)，与模型组比较，其余各治疗组小鼠体重和血糖水平变化无统计学意义(P>0.05)；治疗第20、40天，与空白组比较，模型组小鼠体重均显著降低(P<0.05)，血糖水平均显著升高(P<0.05)，与模型组比较，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠体重均升高(P<0.05)，血糖水平均降低(P<0.05)。见表2。

表2 绿萝花黄酮对DPN小鼠体重和血糖水平影响

2.2 绿萝花黄酮对DPN小鼠运动神经传导速度和热痛反应敏感程度的影响 治疗40 d期间，空白组小鼠热痛反应时间、坐骨神经MNCV和SNCV变化比较差异无统计学意义(P>0.05)，模型组和绿萝花黄酮低剂量组小鼠热痛反应时间逐渐降低(P<0.05)，坐骨神经MNCV和SNCV变化比较差异无统计学意义(P>0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠热痛反应时间、坐骨神经MNCV和SNCV均逐渐升高(P<0.05)；治疗第10 天，与空白组比较，模型组小鼠热痛反应时间、坐骨神经MNCV和SNCV均显著降低(P<0.05)，与模型组比较，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高剂量组热痛反应时间和坐骨神经SNCV均延长(P<0.05)，绿萝花黄酮中剂量组坐骨神经SNCV延长(P<0.05)，其余各项变化比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗第20、40天，与空白组比较，模型组小鼠热痛反应时间、坐骨神经MNCV和SNCV均显著降低(P<0.05)，与模型组比较，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠热痛反应时间、坐骨神经MNCV和SNCV均显著降低均升高(P<0.05)，绿萝花黄酮低剂量组小鼠各项变化比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 绿萝花黄酮对DPN小鼠运动神经传导速度和热痛反应敏感程度的影响

2.3 绿萝花黄酮对DPN小鼠坐骨神经病理改变和血清炎症因子水平的影响 治疗40 d期间，空白组小鼠坐骨神经未出现明显病理改变，有髓神经纤维排列有序，形态正常，模型组可观察到明显结构异常，出现髓鞘脱失、轴突萎缩，且神经纤维排列紊乱松散，出现散在空洞，还可观察到神经纤维断裂，阿卡波糖和绿萝花黄酮各剂量组在治疗后上述情况均得到不同程度改善，且随治疗时间延长改善愈发明显。比较治疗40 d期间各组小鼠血清TNF-α和IL-1β水平，空白组变化无统计学意义(P>0.05)，模型组和绿萝花黄酮低剂量组逐渐升高(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠逐渐降低(P<0.05)；各时间点，模型组小鼠均低于空白组(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中、剂量组高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1(表4)。

表4 绿萝花黄酮对DPN小鼠血清炎症因子水平的影响(ng/ml)

图1 绿萝花黄酮对DPN小鼠坐骨神经病理改变的影响

2.4 绿萝花黄酮对DPN小鼠NF-κB信号通路的影响 治疗40 d期间，模型组和绿萝花黄酮低剂量组小鼠坐骨神经中NF-κB p65蛋白表达量和p-IKKβ/IKKβ、p-IKKα/IKKα比值以及NF-κB、IKKβ、IKKα、NF-κB p65的mRNA相对表达量随治疗时间延长逐渐升高(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠坐骨神经上述指标随治疗时间延长逐渐降低(P<0.05)，空白组各项指标变化无统计学意义(P>0.05)；各时间点，模型组小鼠血清坐骨神经的上述指标均高于空白组(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组小鼠坐骨神经上述指标均低于模型组(P<0.05)，绿萝花黄酮低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.5 绿萝花黄酮对NF-κB信号通路的体外干预作用 干预48 h期间，模型组和绿萝花黄酮低剂量组坐骨神经施万细胞TNF-α和IL-1β水平、NF-κB p65蛋白表达量和p-IKKβ/IKKβ、p-IKKα/IKKα比值以及NF-κB、IKKβ、IKKα、NF-κB p65的mRNA相对表达量逐渐升高(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组坐骨神经施万细胞上述项目除均逐渐降低(P<0.05)，IL-1β水平变化无统计学意义(P>0.05)，空白组各项指标变化无统计学意义(P>0.05)；各时间点，模型组细胞上述指标均高于空白组(P<0.05)，阿卡波糖组和绿萝花黄酮高、中剂量组坐骨神经施万细胞上述指标均低于模型组(P<0.05)，绿萝花黄酮低剂量组与模型组比较各项指标均无统计学意义(P>0.05)，见表5(图3)。

A：治疗40 d各组NF-κB信号通路相关蛋白条带(1：空白组；2：模型组；3：阿卡波糖组；4：绿萝花黄酮高剂量组；5：绿萝花黄酮中剂量组；6：绿萝花黄酮低剂量组)；B～D：各组NF-κB信号通路相关蛋白表达比较；E～H：各组NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达量比较。与同组治疗第10天比较，*P<0.05；与同组治疗第20天比较，#P<0.05；与空白组同时间比较，△P<0.05；与模型组同时间比较，▲P<0.05

表5 绿萝花黄酮对施万细胞血清炎症因子水平的影响(pg/ml)

3 讨 论

DPN引起神经纤维脱髓鞘是周围神经运动、感觉障碍的主要原因，在神经传导研究中测量的所有参数中，SNCV被用来确定感觉神经状态，由于感觉神经纤维脱髓鞘使SNCV减慢，因此能SNCV准确反映髓鞘完整性，而MNCV反映了运动神经纤维髓鞘的完整性[11]。本研究中，绿萝花总黄酮治疗DPN小鼠的40 d期间，小鼠体重逐渐增加，血糖水平不断降低，且热痛反应时间、坐骨神经MNCV和SNCV也逐渐延长，表明绿萝花总黄酮可降低DPN小鼠血糖水平，改善周围神经病变。值得注意的是在治疗第10天时，小鼠坐骨神经MNCV改善效果不明显，且中剂量绿萝花总黄酮仅对坐骨神经SNCV具有改善作用。黄酮类化合物对DPN运动、感觉障碍的改善作用也具有差异性，例如山奈酚仅能提升MNSV[12]，这一差异与可能药物作用机制不同有关，因此研究组认为绿萝花黄酮对DPN小鼠SNCV的短期疗效优于MNCV，而长期来看绿萝花黄酮对DPN引起的运动、感觉神经功能障碍具有较好的疗效。

炎症反应与DPN的发生发展密切相关。血糖长期处于高水平可激活免疫细胞分泌TNF-α，一方面加速脂肪分解，促进肝糖原产生，引起胰岛素抵抗和神经缺血缺氧，进而损伤神经，另一方面TNF-α引起神经脱髓鞘，刺激单核细胞和内皮细胞分泌炎性物质，引起神经炎症[13]。氧化应激是引起DPN的原因之一，氧化应激产生过多的活性氧激活NLRP3炎症小体，然后激活Caspase-1将IL-1β前体切割成为IL-1β并释放到细胞外引起炎症反应[14]，DPN患者外周血中IL-1β水平较高，且有NLRP3 mRNA高表达[15]，而周雯等[16]在DPN大鼠中观察到了类似的结果。Cheng等[17]通过抑制氧化应激和NLRP3炎症小体激活减轻高糖诱导的施万细胞焦亡，与本研究的体内外实验均观察到绿萝花黄酮干预后TNF-α和IL-1β水平降低的结果一致，虽然体外研究中，施万细胞IL-1β水平在48 h内无明显变化，但均明显低于模型组，且DPN小鼠坐骨神经纤维脱髓鞘、轴突萎缩明显改善，表明绿萝花黄酮通过降低TNF-α和IL-1β水平，减轻坐骨神经炎症，改善坐骨神经损伤。

NF-κB信号通路是目前研究最为广泛的炎症通路，NF-κB通路由IKK激活，其中IKKβ主要激活经典NF-κB信号通路，IKKα主要调控非经典NF-κB信号通路，而NF-κB p65则是NF-κB二聚体的组成部分[18]。NF-κB二聚体进入核内，与其多种靶基因结合从而参与多种细胞因子的转录，如IL-1β、IL-6、TNF-α等。NF-κB信号通路与DPN发生发展相关，其介导的促炎反应可造成DPN进一步恶化。Zhao等[19]发现槲皮素通过下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善DPN大鼠运动、感觉功能障碍和炎症因子水平。Adki等[20]发现丹皮酚通过抑制坐骨神经NF-κB和MCP-1表达改善DPN。本研究体内外实验均显示绿萝花黄酮能通过抑制IKKβ和IKKα激活，进而抑制NF-κB二聚体形成和NF-κB信号通路激活，与过去的研究结果类似。

综上所述，绿萝花黄酮可降低DPN小鼠血糖水平，改善运动、感觉神经传导速度，减轻坐骨神经炎症反应，可能与抑制NF-κB信号通路激活相关。