硬段含二硫键聚氨酯复合材料的生物骨黏合性

2022-10-19刘欣畅王新灵肖海军

功能高分子学报 2022年5期

肖伟，刘欣畅，郑震，王新灵，肖海军

（1. 上海交通大学化学化工学院, 上海 200240；2. 上海市奉贤区中心医院骨科, 上海 201400）

骨折是指由于外部创伤或自身病理导致骨组织内损伤的现象，常见于儿童和老人。每年约有数百万人因运动损伤、交通事故、跌倒以及癌症等引起的成骨不全、骨质疏松或骨质退化等疾病而遭受各种骨折[1]。骨钉等金属植入物是目前治疗骨折的主流方式，但仍存在一些临床问题，包括治疗费用高、需二次手术取出、应力屏蔽、小骨碎片难以固定等[2,3]。因此，医用骨黏合剂应运而生。理想骨胶黏剂应满足以下要求：血液等生化条件下具备一定的黏接强度；良好的生物相容性，允许骨髓干细胞的增殖、黏附和分化；易于制备、储存和使用等。目前市面上骨填充支架材料的产品很多，但还没有一种骨黏合剂能够满足所有的临床需要。

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥和磷酸钙（CPC）骨水泥是目前研究较多的两类骨黏合材料。PMMA骨水泥最早在牙科中使用，后来被广泛应用于关节假体固定中[4]。PMMA骨水泥具有生物惰性，难以体内降解，且材料的生物相容性较差，缺乏骨传导性，不利于骨折的恢复和愈合[5]。Zhu等[6]将矿化胶原（MC）加入PMMA骨水泥中，开发了一种生物活性复合骨水泥（MC-PMMA），改善了PMMA的生物相容性。CPC骨水泥主要成分为羟基磷灰石或透钙磷石，与天然骨骼的成分近似，因此具备良好的生物相容性，但CPC骨水泥属于无机材料，自身较脆，与骨骼之间仅为物理作用相互连接，相互作用力不强，在骨科手术中更适合用作填充材料[7]。

除了PMMA和CPC类骨水泥，其他材料也陆续被开发用作骨胶黏剂，如丙烯酸酯类[8]、聚醋酸乙烯酯类[9]、硫醇烯类[10]等。2010年美国有一种商品名为Kryptonite®（氪石骨水泥）的骨水泥被批准临床使用[11]，其主要成分为蓖麻油改性，由多元醇、异氰酸酯和碳酸钙制备的聚氨酯（PU）复合材料。临床病例显示，这种复合黏合材料即使经过6年的使用，与骨表面依旧结合良好，邻近区域的非骨性组织无明显炎症或黏连[12]。在此基础上，本文以二硫键-谷胱甘肽的还原性降解为改性手段，合成了一种含二硫键的脂肪族二元醇（DSU），将其以硬段形式引入聚氨酯胶黏剂体系中，探究了DSU对改性聚氨酯胶黏剂（PU-DSU）的结构和性能的影响，获得了一种黏接性能强、生物相容性优秀的聚氨酯骨胶黏剂。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

蓖麻油：分析纯，上海泰坦科技股份有限公司；催化剂TOYOCAT-TF（牌号）：分析纯，日本东曹株式会社；二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、单质硫：分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司；Na2S·9H2O、6-溴-1-己醇：分析纯，北京伊诺凯科技有限公司；羟基磷灰石(HA)：w=99%，南京埃普瑞纳米材料有限公司；大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)：赛业生物科技有限公司；胎牛血清：Corning公司；DMEM细胞培养基：Gibco公司；染色剂钙黄绿素AM(Calcein-AM): Sigma-Aldrich公司。多巴胺接枝改性蓖麻油多元醇(DACO)：自制，羟值为260 mg KOH/g，接枝率为多巴胺与蓖麻油的物质的量之比，其数值等于1。所有多元醇在使用前均需在110 ℃真空烘箱中干燥2 h除水。

1.2 测试与表征

采用布鲁克公司AVANCE Ⅲ HD 500型核磁共振波谱仪对DSU进行1H-NMR表征；采用MTS公司Criterion 43型万能电子试验机对样品进行压缩性能测试；采用FEI公司Nova NanoSEM 450型场发射扫描电子显微镜对样品进行微观结构表征；采用Kruss公司DSA30型光学接触角测量仪对样品进行表面水接触角测试；将市场购买的新鲜猪肋骨抛光成10 mm×10 mm×40 mm，沿中线切断，采用聚氨酯胶黏剂黏接固定好后，黏接试样用磷酸盐（PBS）缓冲液浸湿的纱布包覆（或浸泡在新鲜兔血液中），分别模拟体内环境，在37 ℃固化24 h后，采用对接拉伸模式测定试样的黏接强度；将样品切成薄片置于0.1 mol/L、pH = 7.4的PBS溶液中，于37 ℃恒温震荡箱中震荡降解，测试样品的体外降解性能；将大鼠BMSCs细胞与支架共培养1、3、5 d后，经Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)处理，采用Tecan公司Infinite M1000 PRO型酶标仪检测细胞培养液在 450 nm波长下的光密度（OD）值；用Calcein-AM对细胞进行染色，采用徕卡公司TCS SP8 STED共聚焦显微镜观察样品的生物相容性。

1.3 实验步骤

1.3.1 DSU的合成[13]准确称取12 g Na2S·9H2O晶体溶于100 mL去离子水中，加入0.8 g硫，升温至40 ℃，搅拌至完全溶解后再加入剩余0.8 g硫，完全溶解后所得溶液即为过硫化钠溶液。称取18.11 g 6-溴-1-己醇溶于100 mL无水乙醇中，逐滴加入过硫化钠溶液中，50 ℃下搅拌过夜。待反应结束后，旋蒸除去乙醇，剩余液体用30 mL乙酸乙酯分2次萃取分液，经无水硫酸钠干燥、过滤除去固体杂质，再旋蒸除去乙酸乙酯，80 ℃真空干燥24 h，所得产物即为DSU。合成反应式见图1。

图1 DSU的合成Fig. 1 Synthesis of DSU

1.3.2 DACO的合成称取100 g蓖麻油、10 g Al2O3、15 g乙酸置于三颈瓶中，转速400 r/min下滴加70 gw=30%双氧水，60 ℃搅拌反应10 h，反应完全后，用w=3%碳酸钠溶液洗至中性，乙酸乙酯萃取，旋蒸得到环氧改性蓖麻油；称取50 g环氧改性蓖麻油溶于100 mL乙醇中，加入19 g盐酸多巴胺、100 mL DMF溶剂和3 g高氯酸锌，用三乙胺调节使体系pH = 8，N2氛围下80 ℃反应24 h，反应结束后，室温下用pH = 2的盐酸溶液洗至中性，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤去除不溶杂质，旋蒸后得到产物DACO，密封保存。

1.3.3 MDI封端预聚体的合成取10 g干燥蓖麻油加入到N2氛围保护的三颈烧瓶中，加入15 g MDI于烧瓶中，加热至80 ℃反应3 h，冷却后得到―NCO封端的预聚体。采用甲苯-二正丁胺法测定聚氨酯预聚体中的剩余―NCO含量，低温密封备用。

1.3.4 PU-DSU的制备以PU-DSU-10（其中10表示m（DSU）∶m（DACO）=10%，其余类推）为例，具体制备方式如下：将3.0 g DACO、135 μL催化剂TOYOCAT-TF、15 μL发泡剂去离子水、0.3 g DSU及0.24 g HA加入烧杯中，在室温下以1 500 r/min搅拌5 min混合均匀。然后按―NCO与―OH官能团物质的量比为1∶1计量加入4.86 g MDI封端预聚体中，1 000 r/min下搅拌30 s，混合均匀后转移至模具中，37 ℃固化24 h。

2 结果与讨论

2.1 DSU的1H-NMR表征

DSU和6-溴-1-己醇的1H-NMR谱图如图2所示。3.41和1.85处的核磁峰对应着Br取代α和β位上的亚甲基基团；当Br被二硫键取代后，由于取代基电负性的降低，α和β位上亚甲基的化学位移会降低至2.68和1.67。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 3.61～3.65 (t,J=7.0 Hz, 2 H), 2.66～2.71 (t,J=7.5 Hz, 2 H), 1.95 (m, 1 H),1.65～1.71 (m, 2 H), 1.55～1.60 (m, 2 H), 1.36～1.44 (m, 4 H)。

图2 6-溴-1-己醇（a）和DSU（b）的1H-NMR谱图Fig. 2 1H-NMR spectra of 6-bromo-1-hexanol (a) and DSU (b)

2.2 PU-DSU的力学性能

PU-DSU形变50%时的压缩性能如图3所示。当DSU的用量（m（DSU）∶m（DACO），下文同）在0～20%时，随着DSU用量的增加，材料的压缩性能呈增强趋势，压缩强度从5.9 MPa增大至8.5 MPa，压缩模量从29.7 MPa增大至59.2 MPa。当DSU用量为10%时，材料的压缩强度为7.0 MPa，压缩模量为41.3 MP。这是由于DSU为短链脂肪族二元醇，羟值和线性结构规整度高，DSU的添加使聚氨酯中硬段结晶度增加，内聚能增加，材料的抗压缩性能增强，压缩强度和压缩模量均得以提升。

图3 PU-DSU的（a）压缩强度和（b）压缩模量Fig. 3 (a) Compressive strength and (b) compressive modulus of PU-DSU

2.3 PU-DSU的微观结构

样品的SEM微观形貌如图4所示。PU与PU-DSU的微孔结构、表观密度和平均泡孔尺寸相差不大，表观密度维持为450～475 kg/m3，平均泡孔尺寸在150 μm左右。这种多孔结构有利于细胞生长和迁移，为骨组织的愈合提供了条件[14]。

2.4 PU-DSU的水接触角

由于DSU为短链脂肪族二醇，结构更规整，DSU的添加会促进氨基甲酸酯等极性基团聚集，造成聚氨酯的微相分离程度加深，所以蓖麻油长链疏水结构对材料表面的影响加深。PU-DSU的水接触角如图5所示。随着DSU用量的增加，PU-DSU静态水接触角呈增大趋势：当不添加DSU时，其接触角为64°；而当DSU的用量为15%时，水接触角增大至80°；当DSU用量为20%时，接触角仅增大至81°。随着DSU用量的增加，PU-DSU的疏水性增强，增幅具有先大后小的特点，说明此时PU-DSU的海-岛分离结构已趋于稳定。

图5 PU-DSU胶黏剂的水接触角Fig. 5 Water contact angle of PU-DSU

2.5 PU-DSU的黏接性能

PU-DSU的黏接强度测试结果如图6所示。在PBS缓冲液体系中，随着DSU用量的增加，胶黏剂的骨组织黏接能力呈现先上升后下降的趋势。当DSU用量为10%时，胶黏剂的骨黏接强度最高可达0.97 MPa；而当DSU用量增至20%时，黏接强度又回跌至0.57 MPa。这是因为与蓖麻油相比，DSU的羟值较高、结构更规整，少量添加会使胶黏剂中起黏接效果的硬段比例增加，黏接性能提升；但骨组织是由磷酸钙盐和蛋白质等组成的有机-无机杂化体系，表面呈亲水性，随着DSU用量的进一步增加，胶黏剂的疏水性增强，表面浸润性变差，黏接强度继而发生下降，故DSU的最佳用量为10%。在新鲜兔血液中的黏接实验同样证实了该结论，由于血液中血红蛋白等生化物质的影响，胶黏剂的黏接强度降低，当DSU的用量为10%时，最大黏接强度为0.49 MPa。据报道，市面上常见的CPC类和PMMA类商品化骨水泥，在水和血液中的最大黏接强度均不超过0.2 MPa[15]。本文所制备的PU-DSU胶黏剂在生物骨黏合方面优势明显。

图6 PU-DSU胶黏剂的骨黏接强度Fig. 6 Bone bonding strength of PU-DSU

2.6 PU-DSU的体外降解性能

PU-DSU-10在不同谷胱甘肽（GSH）质量浓度下的降解情况如图7所示。样品在pH=7.4的PBS缓冲液中水解速率较慢，14周后仅降解0.79%。随着GSH质量浓度的增大，样品的降解速率明显增大，14周后的质量损失率增大至1.24%，降解速率提升57%。

图7 PU-DSU-10在GSH溶液中的降解曲线Fig. 7 Degradation of PU-DSU-10 in GSH solutions

2.7 PU-DSU的生物相容性

PU-DSU-10的生物相容性测试结果见图8。图8 （a）为不同培养时长下BMSCs的细胞活性。在第3 d时，PU-DSU-10样品中的BMSCs细胞数量大幅增加，这可能是因为样品的多孔结构为BMSCs细胞提供了更多的黏附空间，有利于其增殖，但培养基中营养物质有限，一段时间后细胞数量达到均衡。图8 （b）和图8 （c）则显示了BMSCs细胞在样品表面的黏附情况，可以清晰观察到活细胞在样品表面的增殖和黏附，PU-DSU-10具有优良的细胞相容性。