基于电纺PNIPA-AA/PCL纤维基底的细胞膜片制备

2022-10-19汤晓涵郭煦然李东红李慧娟张彦中

功能高分子学报 2022年5期

汤晓涵，唐寒，郭煦然，李东红，李慧娟，张彦中

（东华大学化学化工与生物工程学院, 上海 201620）

基于生物材料支架的传统组织工程方法存在宿主反应强或单细胞悬液注射治疗体内转化率低[1]等局限性。细胞膜片是指通过细胞膜片技术[2]形成的包含完整细胞外基质（ECM）与细胞-细胞间连接的单层膜状细胞集合体结构，该技术可克服上述局限性，因此已受到组织工程领域的广泛关注。目前，单层或通过层-层堆叠的三维细胞膜片已应用于临床受损皮肤[3]、角膜[4]、心脏[5]、牙周[6]、肌腱[7]等的修复治疗，功效十分显著[8]。

经典的细胞膜片技术通常使用温敏材料如聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）在较温和的条件下首先通过电子束辐照[9]、物理或化学吸附[10]、原子转移自由基聚合（ATRP）[11]等方法使PNIPA固定在聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚苯乙烯（PS）培养皿表面形成一层温敏层[12]，然后使目标细胞在温敏培养基底上培养至融合，最后通过将环境温度从37 ℃降低至20 ℃获得细胞膜片（目前已有商业化产品UpCell®用于临床）。但这种通过表面接枝PNIPA的细胞培养基底通常存在细胞膜片脱落时间较长的问题，而长时间处于较低温度会损害细胞活性，影响细胞膜片的完整性与功能。为解决该问题，通过化学接枝引入羧基（-COOH）或羟基（-OH）等亲水基团和使用多孔结构增加基底的水浸润速率已被证明是较好的可加速细胞膜片脱落的改进手段[13-15]。

通过电纺丝方法制备的纳-微米纤维可以较好地仿生细胞生长微环境ECM的超细纤维结构，基于电纺的纳-微米纤维状拓扑基底不仅促进细胞的增殖，快速形成细胞膜片，而且其较高的比表面积也有利于加速基底水润，促进细胞脱落，这些优点将为快速形成高质量细胞膜片提供更合适的细胞生长基底平台。但PNIPA存在可电纺性较差、纤维水浸润后易溶解等问题[16]，虽然提高PNIPA分子量[17]或与疏水性聚合物混和后电纺[18,19]可一定程度上解决上述问题，如Allen等[19]制备了取向PNIPA/聚己内酯（PCL）纤维，当PNIPA在PNIPA/PCL混合物中的质量分数为90%时，在其表面培养的细胞膜片可以较好地脱落，但纤维结构稳定性及细胞膜片脱落速率尚存在较大改进空间。

丙烯酸（AA）改性的PNIPA常被制备成温敏与pH双响应的智能水凝胶而应用于生物医学领域[20]，不加入交联剂聚合得到的链状PNIPA-AA携带大量亲水基团，具有优异的润湿性因而可用于加速细胞膜片脱落。PCL是一种生物相容性良好的疏水性弹性体，与PNIPA混纺不仅有利于改善PNIPA的生物相容性，还可以促进细胞在纤维表面的黏附。本文首先将NIPA与AA通过自由基聚合得到PNIPA-AA聚合物，然后将PNIPA-AA与PCL混合，通过电纺丝方法制备PNIPA-AA/PCL纤维基底，对所制备的纤维基底进行温敏特性表征，最后以小鼠胚胎成纤维细胞（C3H/10T1/2）为模型细胞，研究了PNIPA-AA/PCL纤维基底对细胞膜片形成与脱落的影响及脱落细胞膜片的完整性及功能性。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；AA：化学纯，国药集团化学试剂有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司；聚己内酯（PCL）：重均分子量为8×104，美国Sigma公司；2,2,2-三氟乙醇（TFE）：纯度 ≥ 99.0%，上海达瑞精细化学品有限公司。

C3H/10T1/2：中国科学院干细胞库；含有非必需氨基酸（NEAA）的完全培养基（EMEM）：细胞培养级，上海中乔新舟医药技术公司；Dulbecco’s磷酸盐缓冲溶液（DPBS）：细胞培养级，武汉赛维尔生物科技有限公司；细胞活/死染色试剂盒，美国Thermo Fisher公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）：细胞培养级，碧云天生物科技公司；活细胞示踪剂：细胞培养级，上海懋康生物科技有限公司；4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料、鬼笔环肽（Phalloidin）染料：细胞培养级，美国Invitrogen公司；抗-纤连蛋白（Anti-Fibronectin）抗体、抗N-钙黏素蛋白（Anti-N-Cadherin）抗体、山羊抗兔IgG H&L：细胞培养级，英国Abcam公司。

1.2 PNIPA-AA的合成与表征

将单体NIPA经低温重结晶除去其中的阻聚剂，称取1.0 g NIPA和0.328 g AIBN，加入4 mL无水乙醇至双口烧瓶搅拌均匀，在N2氛围下鼓吹10 min，置于60 ℃水浴反应24 h，制得PNIPA。

称取1.5 g NIPA、0.3 g AA和0.328 g 引发剂AIBN，加入5 mL的无水乙醇至双口烧瓶搅拌均匀，在N2氛围下鼓吹10 min，置于60 ℃水浴反应24 h后，采用截留分子量为1.2×104～1.4×104的透析袋除去未反应的单体与引发剂，在4 ℃冰箱中透析3 d（每隔12 h换水），将透析后溶液放入-80 ℃冰箱中冷冻过夜后冷冻干燥，得到白色固体PNIPA-AA。

将NIPA单体与PNIPA-AA用重水（D2O）溶解后置于核磁管中进行核磁共振氢谱（1H-NMR，瑞士Bruker公司AVANCE400型）分析。采用KBr压片法，用傅里叶变换红外光谱（FT-IR，上海驭锘实业有限公司Nicolet 6700型）仪对合成的聚合物进行结构分析。通过变温红外光谱检测所合成聚合物的温敏特性（KBr压片法+升温附件）。用紫外-可见分光光度计（UV-Vis，日本岛津公司UV3600型）在500 nm波长处测量聚合物水溶液在不同温度下的透光率，以确定其低临界溶解温度（LCST）。为宏观检测温敏性，将聚合物配制成质量浓度为0.005 g/mL的水溶液，分别在25 ℃和40 ℃下观察聚合物在水中的溶解和析出形态变化。

1.3 PNIPA-AA/PCL纤维基底的制备与表征

先将PNIPA以100 mg/mL的质量浓度溶于无水乙醇，然后在已清洗处理并干燥后的圆形玻片（直径14 mm）上滴加200 μL配制好的PNIPA溶液，最后用美国LaureⅡ公司WS-650MZ-23NPPB型匀胶机以3 000 r/min转速旋涂30 s[21]，由此得到PNIPA薄膜涂层基底（PNIPA-c）。将得到的旋涂玻片放入真空干燥箱中备用。

将PNIPA、PNIPA/PCL（m(PNIPA)∶m(PCL)=9∶1）[19]、PNIPA-AA/PCL （m(PNIPA-AA)∶m(PCL)=3∶1）分别溶于TFE中，配制成质量浓度为0.2 g/mL的纺丝液，然后将纺丝液装入附有针头（内径为0.6 mm）的5 mL塑料注射器中电纺（20～25 ℃，相对湿度50%～60%，纺丝速率1.1 mL/h，电压9～11 kV，接收距离14～15 cm）。由此分别得到PNIPA纯纺纤维（PNIPA-f）、PNIPA/PCL混纺纤维和PNIPA-AA/PCL混纺纤维。通过在直径为14 mm的玻片上沉积电纺纤维制得用于细胞培养的纤维基底。将各电纺纤维样品在真空干燥箱中干燥处理备用，其制备示意图如图1所示。

图1 PNIPA-AA/PCL纤维基底的制备及细胞膜片获取示意图Fig. 1 Schematic of electrospun fibrous PNIPA-AA/PCL substrate formation and cell sheet harvest

使用扫描电子显微镜（SEM，日本JEOL公司JSM-5 600型）在10～15 kV加速电压下观察PNIPA-c及各电纺纤维基底（PNIPA-f、PNIPA/PCL、PNIPA-AA/PCL）的形貌，并使用Image J软件分析纤维直径（样品数n≥ 50）。

使用接触角测量仪（德国克吕士公司DSA30型）分别在20 ℃和37 ℃下测试去离子水液滴（2 μL）滴落到基底表面30 s时的接触角（样品数n≥ 5），并通过摄像模式记录20 ℃下液滴滴落在基底表面后完全浸润消失时的时间。

1.4 细胞膜片的制备与功能检测

1.4.1 细胞培养将C3H/10T1/2在EMEM（含有NEAA）完全培养基中复苏、培养和传代。细胞接种前，将沉积在玻片上的纤维样品放入24孔细胞培养板中，并用定制的不锈钢环固压，紫外光照射灭菌12 h，种板前添加经37 ℃水浴预热过的培养基预培养4 h，然后将C3H/10T1/2接种在PNIPA-c、PNIPA-f、PNIPA/PCL及PNIPA-AA/PCL这4组基底上（全程在37 ℃恒温加热台上操作），在37 ℃、 CO2体积分数为5%的条件下培养细胞，每2 d更换1次培养液。

1.4.2 细胞增殖检测将C3H/10T1/2以每孔2 × 104个的细胞密度接种于4组基底上，在24孔培养板中培养1、2、3 d。通过CCK-8比色法检测细胞增殖，具体步骤如下：吸出培养液，每孔加入285 μL培养基和15 μL CCK-8试剂的混合液，37 ℃孵育4 h后，取100 μL的细胞培养液至96孔板中，在450 nm波长处测量吸光度（OD）。

1.4.3 细胞骨架染色将C3H/10T1/2以每孔1 × 104个的细胞密度接种于4组基底上，培养1 d后进行DAPI和Phalloidin染色。具体步骤如下：吸去培养基，在37 ℃下用质量浓度为0.04 g/mL的多聚甲醛溶液对细胞固定20 min，加入Triton X-100溶液通透10 min；用200 μL Phalloidin染色液避光染色细胞骨架30 min，用200 μL DAPI染色液室温避光染色细胞核10 min；通过倒置荧光显微镜观察肌动蛋白（F-actin）骨架形态。

1.4.4 免疫荧光染色将C3H/10T1/2以每孔5 × 105个的细胞密度接种于4组基底上，培养7 d后观察细胞-细胞间连接及细胞外基质分泌情况。具体步骤如下：首先将形成的细胞膜片放在37 ℃恒温加热台上，使用质量浓度为0.04 g/mL的多聚甲醛溶液固定20 min，每孔加入Triton X-100溶液通透10 min；然后加入200 μL封闭液封闭30 min以阻断非特异性染色；接着加入200 μL的N-钙黏素（N-cad）与纤连蛋白（Fn）一抗稀释液，4 ℃下孵育过夜；再添加200 μL带荧光物质标记的二抗稀释液山羊抗兔IgG，室温下避光孵育2 h；最后每孔加入200 μL的DAPI染料对细胞核进行染色。染色24 h内使用倒置荧光显微镜观察和拍照。使用Image J进行荧光定量分析。

1.4.5 细胞膜片的脱落通过降温至20 ℃的方法使温敏材料溶解，从而使细胞膜片从基底材料表面脱落。为减弱低温下细胞在各表面的黏附，加入不含钙镁离子的DPBS以使细胞膜片分离更彻底[22]。步骤如下：吸去培养基，每孔加入1 mL预冷的DPBS缓冲液浸泡3次，每次间隔2 min；在20 ℃下静置10 min后轻轻摇晃，将膜片轻缓分离。

1.4.6 活细胞示踪剂染色通过活细胞示踪剂染色检测细胞膜片脱落情况。将C3H/10T1/2以每孔5 × 105个的细胞密度接种到4组基底并培养7 d后，每孔加入300 μL荧光示踪剂染料，放入37 ℃培养箱避光孵育30 min（全程换液操作在37 ℃加热台上进行）。通过荧光倒置显微镜观察细胞膜片形成情况；通过1.4.5节中的细胞脱落方法使细胞膜片脱落，之后再次通过荧光倒置显微镜观察各基底上剩余的未脱落细胞。通过Image J软件统计各基底上脱落前细胞数（n0）与脱落后剩余的细胞数（n1），计算细胞脱落率。

1.4.7 细胞膜的转移将脱落的细胞膜片通过剪去尖端的1 mL无菌枪头吸取后，立刻转移释放至新的24孔细胞培养板中，使用移液泵从液面最上层开始，小心吸净DPBS缓冲液，加入完全培养基继续在37 ℃下培养。

1.4.8 活/死细胞染色通过活/死细胞染色方法评估转移后细胞膜片的活力。步骤如下：将上述1.4.7节中转移的细胞膜片在37 ℃下培养2 d后，使用PBS清洗细胞3次；将活/死细胞染料以每孔200 μL的量加入到孔板中，放入37 ℃培养箱中避光孵育30 min；将染料吸去后用PBS清洗细胞3次，通过倒置荧光显微镜进行观察。

1.5 统计分析

所有数据以平均值±标准差表示，采用Graphpad Prism 8.0和Origin 8.0 软件对实验数据进行分析，用单因素方差（One-Way ANOVA）分析数据间是否有显著性差异。当*p＜ 0.05时认为有显著性差异，当**p＜ 0.01时认为有极显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 PNIPA-AA的表征

PNIPA和PNIPA-AA的1H-NMR图谱如图2（a）所示。化学位移为6.10处（峰a）的峰为=CH2的特征峰，5.70处（峰b）为不饱和双键中的叔碳=C―的特征峰；3.87处（峰c）为酰胺基团中的-NH-的特征峰；1.08处（峰d）为异丙基中的-CH3的特征峰；1.90和1.55处（峰e、f）为双键消失后的次甲基―CH―和亚甲基―CH2―的特征峰； 2.75处（峰g）为AA中的次甲基―CH―的特征峰； 4.24处（峰h）为AA部分的羟基―OH的特征峰。单体的双键信号峰（a、b）消失，证明PNIPA与PNIPA-AA的成功聚合[23]。

图2 （a）核磁共振氢谱图；（b）红外光谱图；（c）PNIPA-AA变温红外光谱图；（d）聚合物水溶液在不同温度下的透光率曲线；（e）PNIPA和PNIPA-AA在不同温度下的溶液中析出/溶解宏观形貌变化Fig. 2 (a) 1H-NMR spectra; (b) FT-IR spectra; (c) Temperature-dependent FT-IR spectrum of PNIPA-AA; (d) Optical transmittance of aqueous polymer solutions at varied temperatures; (e) Macroscopic observation of morphological changes of precipitation/dissolution of PNIPA and PNIPA-AA

FT-IR光谱（图2（b））显示了PNIPA和PNIPA-AA的特征吸收峰，1 546 cm-1和1 650 cm-1处的吸收峰归属于PNIPA酰胺基团中的-NH-键和C=O键的特征吸收峰；1 719 cm-1处的吸收峰为AA羧基的C=O拉伸振动峰；1 368 cm-1和1 388 cm-1处的吸收峰为异丙基上双甲基的对称弯曲振动峰。以上结果也表明成功合成了PNIPA和PNIPA-AA[23]。

变温红外光谱[24]（图2（c））显示，不同检测温度下，PNIPA-AA仅在3 300～3 600 cm-1有明显区别，这一范围内3 420 cm-1处吸收峰为AA中羟基的拉伸振动峰，这是PNIPA-AA与空气中水分子结合形成氢键的体现。随着温度升高，吸收峰面积变小，氢键稳定性变差，与水分子结合能力下降，说明PNIPA-AA具有温敏性，且其温敏性与分子结构中同水分子结合形成氢键的稳定性有关。

LCST是聚合物水溶液在500 nm波长下透光率降至一半时所对应的温度[25]。聚合物溶液在不同温度下的透光率曲线（图2（d））表明，PNIPA与PNIPA-AA的LCST分别为30.4 ℃和33.6 ℃，接近人体温度，从而确保后续实验中细胞膜片可通过降温方法实现脱落。AA单体中亲水基团-COOH的引入提高了聚合物PNIPAAA的LCST[23]。聚合物溶液宏观上（图2（e））表现为：室温下呈澄清状态，随着温度升高逐渐变浑浊，最后从溶液中析出。

2.2 PNIPA-AA/PCL纤维基底的表征

各组基底的SEM形貌结果如图3（a）显示，PNIPA-c表面旋涂平整；PNIPA-f纤维较细并存在极细的纤维，形貌不均，平均直径为（133.9 ± 60.1）nm；引入PCL后，PNIPA/PCL纤维直径变粗，局部出现纺锤形串珠结构[26]，平均直径为（507.9 ± 127.3）nm；嫁接AA并与PCL混纺后，可电纺性明显提升，且所制备的PNIPAAA/PCL纤维形貌更加均一，平均直径为（472.4 ± 72.9）nm。

图3 各组基底的（a）SEM形貌图；（b）水接触角；（c）水浸润速率Fig. 3 (a) SEM images, (b) water contact angles and (c) water infiltration rates of different substrates

水接触角测试结果（图3（b））显示，在低温（20 ℃）下4组基底均具有亲水特性，在高温（37 ℃）下4组基底表面相对疏水。比较而言，PNIPA-AA/PCL温敏纤维在37 ℃下比其他2组更能维持相对疏水状态，说明疏水组分PCL的引入可增加PNIPA纤维在水溶液中的疏水性和结构稳定性。4组基底在20 ℃下水完全浸润表面的时间统计结果如图3（c）显示，PNIPA-AA/PCL纤维基底表面液滴约28 s完全浸润表面，表明通过引入亲水基团-COOH可以实现快速浸润。以上结果显示，4组基底均存在温敏性，符合用于制备细胞膜片的基底温敏特性要求。

2.3 PNIPA-AA/PCL纤维基底对细胞膜片形成与脱落的影响

细胞增殖结果（图4（a））显示，细胞在4组基底均能增殖，第3 d时PNIPA/PCL与PNIPA-AA/PCL纤维基底对细胞的增殖能力显著高于PNIPA-c和PNIPA-f组，且PNIPA-AA/PCL组显示出较好的促细胞增殖能力，这有利于快速形成细胞膜片。

图4 （a）第1 d、2 d、3 d的细胞增殖情况；（b）第7 d时的 N-cad与Fn免疫荧光染色（细胞核蓝色和蛋白绿色）；（c）第7 d时的活细胞示踪剂染色；（d）细胞膜片的细胞脱落率统计；（e）第7 d时的细胞膜片脱落前后的细胞骨架形貌（细胞核蓝色和细胞骨架红色）；（f）细胞膜片实物图Fig. 4 (a) Cell proliferation at 1 d, 2 d, and 3 d; (b) Immunofluorescence staining of N-cad and Fn at 7 d (Nuclei blue and protein green);(c) Live cell tracking staining at 7 d; (d) Cell detachment rates; (e) Cytoskeletal morphology before and after detachment of cell sheets at 7 d (Nuclei blue and cytoskeleton red); (f) Photographs of detached cell sheets

当细胞培养至融合后即具有脱落的潜力，为获取ECM更完整的细胞膜片，各组细胞培养时间统一设定为7 d。N-cad是一种介导细胞与细胞相互连接的糖蛋白分子，常被用于检测细胞膜片的完整性；而在细胞与其胞外基质黏附中起重要作用的Fn则可用于评估成纤维细胞膜片中的ECM分泌情况。培养7 d的免疫荧光染色结果（图4（b））显示，PNIPA-AA/PCL纤维组N-cad表达量更高，细胞间连接紧密，且PNIPA-AA/PCL纤维组分泌的Fn更多，形成的细胞外基质更完整。说明适当提高PCL的含量，一方面提高了PNIPA的生物相容性[19]，有利于缓解PNIPA可能存在的降解毒性[27]，另一方面也为细胞提供更多疏水位点黏附，并且仿生ECM纤维的拓扑结构，从而更好地促进细胞增殖，诱导细胞外基质分泌，快速形成良好的细胞膜片。

细胞膜片脱落结果（图4（c））显示，降温后4组细胞膜片均能脱落，PNIPA/PCL 和PNIPA-AA/PCL纤维基底组获取的细胞膜片更紧密，完整性更好。统计脱落后基底剩余细胞数，并计算细胞脱落率（图4（d）），PNIPA-c组的细胞脱落率仅为70%，其余3组均在90%以上，并以PNIPA-AA/PCL纤维基底组最高。

通过细胞骨架染色观察培养至第7 d的细胞膜片脱落前后的细胞骨架变化（图4（e）），未脱落前各组细胞膜片骨架轮廓清晰，应力纤维明显，整体比较致密整齐；脱落后PNIPA-c、PNIPA-f和PNIPA/PCL组细胞膜片骨架变得不规整，轮廓逐渐不清晰，而PNIPA-AA/PCL纤维基底上的细胞却能较好克服这种收缩力，骨架依旧维持原型，这可能与膜片快速脱落及完整度更高的细胞外基质对细胞骨架重排影响较少有关[28]。

从各组细胞膜片实物图（图4（f））可以看出，PNIPA-c组细胞膜片破碎明显且完整性较差，PNIPA-f和PNIPA/PCL纤维基底细胞膜片较完整，而PNIPA-AA/PCL纤维基底细胞膜片完整度最高。PNIPA-c、PNIPA-f、PNIPA/PCL基底的平均脱落时间分别为30、14、16 min，而PNIPA-AA/PCL纤维基底仅需约10 min即可达到细胞膜片完全分离，脱落时间显著缩短。

以上结果表明，PNIPA-AA/PCL纤维基底由于侧链富含亲水基团以及比表面积较大，水浸润程度更高，细胞膜片从基底表面分离更彻底，低温下水浸润速率更快，细胞膜片分离所需时间大大缩短，细胞处于低温环境时间更短，导致细胞膜片收缩程度更小。

2.4 PNIPA-AA/PCL纤维基底对脱落后膜片完整性与功能的影响

4组细胞膜片脱落后N-cad和Fn免疫荧光染色照片及脱落前后荧光定量对比如图5（a，b）所示。相比于其他3组，PNIPA-AA/PCL纤维基底细胞膜片脱落前后细胞间连接蛋白、ECM蛋白表达不存在显著性差异，说明降温脱落后细胞膜片仍保留较紧密的细胞-细胞间连接与较完整的ECM。这可能是由于细胞脱落时间短，对细胞造成的损害更小；同时在DPBS的协同作用下，细胞膜片分离更彻底，保留了更完整的胞外基质蛋白。这种保持较高完整性与功能性的细胞膜片通过移植修补，或代替受损组织，或细胞膜片的旁分泌作用释放生长因子治疗功能失调组织。

图5 （a）脱落后细胞膜片N-cad和Fn的免疫荧光染色（细胞核蓝色和蛋白绿色）；（b）分别对图4（b）和图5（a）中的荧光强度定量分析；（c）脱落后再黏附细胞活/死染色（活细胞绿色和死细胞红色）Fig. 5 (a) Immunofluorescence staining of N-cad and Fn after detachment of cell sheets (Nuclei blue and protein green); (b) Quantitative analysis of fluorescence intensity in Fig.4(b) and Fig.5(a); (c) Live/dead staining of adherent cells after being harvested (Live cells green and dead cells red)

将收获的细胞片转移到新的24孔细胞培养板中，加入完全培养基并在37 ℃下培养2 d，活/死染色结果（图5（c））表明，4组细胞膜片健康且质量良好，移植后均可再黏附增殖，细胞存活率分别为（69.0 ± 2.6）%、（72.0 ± 2.4）%、（84.0 ± 1.9）%和（91.0 ± 2.3）%。说明从PNIPA-AA/PCL纤维基底组获取的细胞膜片完整性与功能性保持良好，且再转移后细胞活力仍处于较高水平。