肺泡灌洗液中性粒细胞比例联合革兰染色对肺炎的诊断效能研究

盛梦秋 张玉 张淇玮 张鑫强 侯铁英，

1广东省人民医学院（广东省医学科学院），广东省心血管病研究所，广东省临床检验中心（广州510120）；广东省人民医院（广东省医学科学院）2检验科，3医务处（广州 510120）

肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，根据获得环境，可分为社区获得性肺炎（communityacquired pneumonia，CAP）和医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）［1］。HAP 是我国最常见的医院获得性感染，诊断治疗较为困难，病死率高［2-3］。据世界卫生组织报道，2010-2019年下呼吸道感染已成为感染性疾病中死亡人数最多的疾病，尽管死亡总人数有减少［4］。肺炎常用的微生物学检验方法为涂片革兰染色镜检和病原微生物培养［5］。临床上肺炎送检标本多为痰标本，但痰标本的采集多出现被口腔内细菌污染的情况，革兰染色镜检无法区分病原体是定植或感染，培养所需时间较长，且二者阳性率均不高。支气管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）污染率较低，并且病原菌检出率高于痰液、血液［6-7］。WALTER 等［8］发现BALF 中性粒细胞比例下降50%对危重细菌性肺炎的患者阴性预测效能高达90%。也有研究发现，呼吸道样本革兰染色（gram staining）有助于呼吸机相关性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）的早期诊断，指导抗生素使用［9-10］。但目前BALF 中性粒细胞比例对肺炎诊断尚无明确标准。本研究回顾性分析肺炎患者肺泡灌洗液中性粒细胞比例，联合革兰染色对肺炎进行诊断，并对其诊断效能进行评估。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究纳入2018年9月至2021年5月期间在广东省人民医院气管镜室送检呼吸内科BALF 标本的住院患者。共188 例患者纳入研究，肺炎患者108 例为实验组，非肺炎患者80 例为对照组，肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34 例。通过医院信息系统（hospital information system，HIS）、实验室信息管理系统（laboratory information management system，LIS）对患者的人口学特征、临床资料和实验室检查结果进行查询，收集患者人口学特征、出入院诊断、抗生素使用、住院天数、临床诊断、疾病转归、患者BALF 中性粒细胞比例、BALF革兰染色等临床信息和实验室检查结果。本研究经广东省人民医院伦理委员会审批通过。

1.2 分组和方法 入选标准：（1）年龄≥18 岁；（2）行支气管镜留取BALF 标本送检的住院患者，（3）临床诊断与实验室结果一致。排除标准：（1）BALF 不合格标本≤5 mL；（2）患者病例资料不全。依据CAP 和HAP 诊断和治疗指南［4，11］，结合临床诊断，将患者分为肺炎组和非肺炎组。肺炎组包括CAP 和HAP 患者，非肺炎包括非病原菌感染的肺部疾病，如肺癌、肺结节、慢性阻塞性肺病等行支气管肺泡灌洗的患者。BALF 的实验室预处理遵循中华医学会呼吸病学分会专家共识［12］。

1.3 诊断标准 依据2016年中华医学会呼吸病学分会修订的《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》。CAP 临床诊断标准：（1）社区发病；（2）肺炎相关临床表现：新近出现的咳嗽咳痰或原有呼吸道疾病加重，伴或不伴脓痰、胸痛、呼吸困难及咯血；肺实变体征和（或）闻及湿啰音；发热；外周血白细胞＞109/L 或＜4 × 109/L，伴或不伴细胞核左移；（3）胸部影像学检查显示新出现的斑片状浸润影、叶或段实变影、磨玻璃影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。符合（1）（3）及（2）中任何一项，并除外其他肺部疾病后，可建立临床诊断［4］。

依据2018年中华医学会呼吸病学分会感染学组制定的《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南》。HAP 是指患者住院期间没有接受有创机械通气、未处于病原感染的潜伏期，而于入院48 h 后新发生的肺炎［11］。

1.4 统计学方法 运用SPSS statistics 21.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料采用（）表示。采用偏度-峰度检验法来检验各组数据的正态性，并采用分位数图（Q-Q plot）来验证。若该资料服从正态分布，则使用独立样本的t检验，非正态分布采用曼-惠特尼U检验（Mann-WhitneyUtest）。计数资料用χ2检验或者Fisher 确切概率法。制作ROC曲线，通过曲线下面积（area under curve，AUC）对指标诊断效能进行分析，采用logistic 回归分析制作BALF 中性粒细胞计数联合镜下染色鉴别诊断肺炎和非肺炎的ROC 曲线，灵敏度和特异度。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本情况 本次共收集肺炎患者108 例，非肺炎患者80 例。肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34例；80 例革兰染色镜下可见病原菌。两组患者的年龄、性别等资料进行比较，肺炎患者中男性比例较高（P＜0.001），BALF 中性粒细胞比例肺炎组明显高于非肺炎组（P＜0.01），革兰染色结果差异有统计学意义（P＜0.001），其余差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 患者临床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients ±s

表1 患者临床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients ±s

注：a 镜下可见病原菌

年龄（岁）男性［例（%）］住院天数（d）使用抗生素［例（%）］BALF中性粒细胞比例（%）革兰染色a（%）好转［例（%）］肺炎（n=108例）64±15 83（76.9）13±10 92（85.2）73.75±42.05 80 87（80.6）非肺炎（n=80例）63±17 36（45.0）10±6 52（65.0）28.85±46.25 0 60（75.0）P值0.296 0.001 0.423 0.072＜0.01 0.001 0.074

2.2 BALF 中性粒细胞在CAP 患者及HAP 患者中的分布 本实验CAP 患者74 例，HAP 患者34 例。CAP 组和HAP 组的数据不服从正态分布，二者方差不齐，因此采用Mann-WhitneyU检验对两组样本进行比较，得P＞0.05，CAP 和HAP 患者中BALF中性粒细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 CAP 患者及HAP 患者中BALF 中性粒细胞比例的分析结果Tab.2 The results of neutrophil ratio in BALF of patients with CAP and HAP ±s

表2 CAP 患者及HAP 患者中BALF 中性粒细胞比例的分析结果Tab.2 The results of neutrophil ratio in BALF of patients with CAP and HAP ±s

项目中性粒细胞（%）CAP（n=74例）71.55±41.78 HAP（n=34例）75.25±50.88 Z值-0.443 P值＞0.05

2.3 ROC 曲线分析

2.3.1 BALF 中性粒细胞比例鉴别诊断肺炎的ROC 曲线及分析 在鉴别诊断肺炎与非肺炎中，BALF 中性粒细胞比例AUC 分别是0.728，Cut-off值为41.45，灵敏度为0.750，特异度为0.675。见图1。

图1 BALF 中性粒细胞诊断肺炎ROC 曲线Fig.1 The ROC curve of BALF neutrophils ratio in diagnosis of pneumonia

2.3.2 BALF 中性粒细胞比例联合革兰染色鉴别诊断肺炎的ROC 曲线及分析 对两组数据进行logistic 回归分析，使用二元logistic 回归分析，得到logistic 回归方程的常数项以及各项系数，可得回归方程logit（P）=1.128+0.064 革兰染色-0.031 中性粒，可得联合预测因子=革兰染色-中性粒*0.031/0.064。构建联合因子鉴别诊断肺炎与非肺炎的ROC 曲线，如图2，AUC 为0.731，Cut-off 值为22.09，灵敏度分别是0.724，特异度为0.703。

图2 BALF 中性粒细胞比例联合革兰染色诊断肺炎的ROC 曲线Fig.2 The ROC curve of BALF neutrophil ratio combined with gram stain in diagnosis of pneumonia

2.3.3 BALF 中性粒细胞不同比例对肺炎的诊断灵敏度、特异度特征 评价肺炎患者中不同中性粒细胞比例灵敏度、特异度特点，中性粒细胞比例≥20%，特异度为25%，阴性预测值较高为75%；中性粒细胞比例≥80%的时候灵敏度最高为97.4%，特异度最低为11.3%，阳性预测值较高为80.5%。如表3。

表3 BALF 中性粒细胞比例对肺炎的诊断灵敏度、特异度特征Tab.3 Sensitivity and specificity of BALF neutrophil ratio in diagnosis of pneumonia

3 讨论

肺炎已成为全球感染性疾病死亡的主要原因之一［2］。我国目前尚无成人CAP 发病率数据，仅有年龄构成比的研究［3］，CAP 和HAP 的发病率和死亡率均随着年龄的增加而升高［4，8］。我国一项大规模医院感染横断面研究［11］结果表明，住院患者医院获得性感染的发生率为3.22% ～5.22%，其中医院获得性下呼吸道感染率为1.76% ～1.94%。ANGUS 等发现，肺炎是重症监护室（intensive care unit，ICU）和非重症监护室（non-intensive care unit，non-ICU）患者主要的住院死亡原因［13］。我国不同地区HAP 和CAP 的致病菌分布和耐药性有很大的区别，不同程度病原菌耐药给CAP 和HAP 的治疗带来困难［11］，肺炎诊断的不确定和病因不明易导致未感染患者抗生素的过度使用，增加抗生素的耐药性。因此，找到快速、有效的肺炎早期诊断指标，减少抗生素的过度使用是非常有必要的。

目前常见肺部病原微生物检测方法有涂片染色镜检、培养基培养、血清检测、核酸检测和宏基因组二代测序计数（metagenomics next generation sequencing，mNGS）等，涂片镜检存在一定的漏检率，培养、核酸检测和mNGS 的报告时间至少需要24 h［14］，都不是快速有效的肺炎诊断治疗相关指标，尤其是在重症患者中，无法快速指导治疗方案。有研究者提示细胞学检查在感染性疾病诊断中的重要性［15］在肺部急性炎症反应中，中性粒细胞（neutrophils）是最先进入肺损伤部位的反应细胞［16］，对鉴别感染有较好的临床效能［17］，且BALF中3%感染细胞对肺炎有较高的预测价值［18］。有学者建议肺泡灌洗液检查与细胞特殊染色相结合，可以快速识别微生物病原体引起的肺炎，及时指导抗生素治疗，降低死亡率［19］。

有研究表明，BALF 中性粒细胞比例与肺结节病、弥漫性肺泡损伤、特发性肺纤维化、硬皮病等疾病有关，这些非病原体感染肺部炎症反应疾病均会导致BALF 中性粒细胞比例升高［20-21］，由表1可见两组患者抗生素使用率较高，抗生素的经验性使用对BALF 中性粒细胞比例也有一定的影响，因此BALF 中性粒细胞比例升高并不能作为诊断肺炎的唯一标准。由表3 可知，肺炎患者中BALF中性粒细胞比例越高，诊断肺炎的灵敏度越高，阳性预测值也越高，对肺炎的早期诊断、早期治疗、改善预后有更大的意义。

本研究回顾性纳入了188 例呼吸内科住院患者，其中肺炎诊断108 例，非肺炎诊断80 例，肺炎患者中CAP 74 例，HAP 34 例，分析发现肺炎组患者BALF 中性粒细胞计数明显高于非肺炎患者（P＜0.01），但在CAP 和HAP 患者中差异无统计学意义（P＞0.05）。通过ROC 曲线分析，BALF 中性粒细胞比例鉴别诊断肺炎和非肺炎的AUC 为0.728，Cut-off 值为41.45，灵 敏度0.750 和特异度0.675，有一定的诊断效能。BALF 中性粒细胞比例联合镜下革兰染色鉴别诊断肺炎和非肺炎患者的AUC 为0.731。联合诊断效能稍高于单一BALF 中性粒细胞比例的诊断效能，BALF 中性粒细胞比例Cut-off 值为22.09，表明在得知革兰染色结果的情况下，BALF 中性粒细胞比例高于22.09%，提示肺炎的可能性大，且其特异度明显高于单一使用BALF 中兴粒细胞比例鉴别诊断肺炎和非肺炎患者，对肺炎的诊断更具有准确性。

本研究同时也具有一定的局限性，SONG 等［22］发现流式细胞仪可提高BALF 中细胞检测的敏感性，我院BALF 中性粒细胞计数是依靠人工镜检来检测，具有一定的误差性，对结果有一定的影响。BALF 在采样过程中灌洗的部位和灌洗液回收量、标本的预处理都有可能影响到BALF 细胞分类计数［12，23］。在对肺炎患者的分析中并未对感染病原菌进行分类分析，可进一步对BALF 中性粒细胞比例在细菌和真菌性肺炎中的诊断效能进行研究。并且，本研究为单中心回顾性研究，多中心前瞻性研究是有必要的。

综上所述，BALF 中性粒细胞比例对肺炎具有较高的诊断效能，对重症患者早期治疗有提示意义。BALF 中性粒细胞比例联合革兰染色对肺炎患者有一定的早期诊断效能，对患者个体化治疗和抗生素方案有一定指导作用，但需结合患者的临床症状和影像结果等进行多方位评估。