右美托咪定对宫颈癌细胞HSP90/ERK通路及顺铂敏感性的影响

2022-10-19杨利利胡强夫闵娜王涛

实用医学杂志 2022年16期

杨利利胡强夫闵娜王涛

1郑州大学第五附属医院麻醉科（郑州 450052）；2郑州大学第三附属医院麻醉科（郑州 450000）

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，虽然近年来其发病率、死亡率有所降低，但晚期患者5年生存率不足40%，仍是导致女性死亡的重要原因［1-2］。宫颈癌治疗主要以手术辅助放化疗为主，但对化疗药物的耐药性往往影响化疗疗效，难以达到预期的临床效果，导致预后结局差［3］。因此，寻找一种安全有效的途径增强化疗敏感性，对改善宫颈癌预后具有重要研究、应用价值。热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）可维护正常组织蛋白稳定性，作为ATP 依赖性分子伴侣能参与肿瘤细胞生存、代谢过程，抑制其表达可逆转肿瘤的顺铂耐药性［4］。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）活化后可调控一系列转录因子，参与细胞的异常增殖分化过程，在肿瘤进展、治疗机制中均具有重要作用［5］。有研究发现，触发HSP90-ERK 途径介导的食管鳞状细胞癌DNA 修复可增强顺铂化学耐药性［6］。右美托咪定是一类脂溶性的α2 肾上腺素激动剂，常用于临床辅助手术麻醉，近年来在肿瘤根治术中广泛应用。此外，右美托咪定能抑制宫颈癌细胞的存活与转移［7］，减轻化疗相关性恶心呕吐［8］，且研究报道其能提高肺癌细胞A549 对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性［9］。为明确右美托咪定应用于宫颈癌的根治术、放化疗等过程中是否有利于肿瘤治疗，本研究从细胞层面上，探索右美托咪定对宫颈癌细胞HSP90/ERK 通路及顺铂敏感性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 常用试剂与仪器人HeLa（HZ-CC100769），美国ATCC；顺铂（JKLN003484a）、右美托咪定（JKLN010388a），上海经科；DMEM 培养基（KLP0032），德国merck/sigma；抗体：HSP90（ab13495）、ERK（ab184699）、p-ERK（ab201015）、DNA 甲基转移酶1（DNA methyltransferases1，DNMT1）（ab19905）、DNA 聚合酶δ 催化亚基（DNA polymerase delta catalytic subunit gene 1，POLD1）（ab196561）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（ab18197）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（ab104156）、GAPDH（ab181602），美国abcam；CCK-8（CK-04），日本同仁；AnnexinV-FITC/PI 试剂盒（S0185）购自哈尔滨新海基因检测有限公司；化学发光成像系统（ChemiDocXRS）、酶标仪（MODEL550），美国Bio-Rad；流式细胞仪（BD FACSCanto Ⅱ），美国BD。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 HeLa 细胞用DMEM 培养基培养，融合80%左右时消化、传代。

取对数期HeLa 细胞接种96 孔板（1 × 104个/孔），分为对照组（不做处理）、顺铂组（5 μg/mL 顺铂）、低浓度组（5 μg/mL 顺铂+3 μmol/L 右美托咪定）和高浓度组（5 μg/mL 顺铂+6 μmol/L 右美托咪定）。

1.2.2 Western blot 法检测蛋白表达各组细胞培养48 h 收集，提取总蛋白，定量。电泳、转膜、封闭1 h 后，分别于4 ℃加HSP90 抗体、ERK 抗体、p-ERK 抗体、DNMT1 抗体、POLD1 抗体、PCNA 抗体、Bax 抗体、GAPDH 抗体（1∶500）过夜孵育，再室温孵育羊抗兔二抗（1∶5 000）1 h，化学发光，拍摄图像，分析蛋白灰度，以内参GAPDH 为对照定量。

1.2.3 CCK-8 法检测增殖各组细胞培养48 h，加10 μL CCK-8 溶液，培养2 h，酶标仪（450 nm）检测吸光度（optical density，OD）值。

1.2.4 流式细胞仪检测凋亡各组细胞培养48 h收集，消化、洗涤后调整为1 × 106个/mL，用5 μL Annexin V-FITC 及5 μL PI 避光孵育1 h，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法数据以（）表示，采用Graph-Pad 软件进行多组间比较（单因素方差分析）和进一步两两比较（SNK-q检验），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HeLa 细胞中HSP90/ERK 通路相关蛋白表达情况与对照组相比，顺铂组HeLa 细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与顺铂组相比，低浓度组HeLa 细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与低浓度组相比，高浓度组HeLa 细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图1、表1。

表1 各组HeLa 细胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表达水平比较Tab.1 Comparison of HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1 and POLD1 protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s

注：较对照组，aP ＜0.05；较顺铂组，bP ＜0.05；较低浓度组，cP ＜0.05

组别对照组顺铂组低浓度组高浓度组F 值P 值HSP90/GAPDH 0.90 ± 0.14 0.73 ± 0.11a 0.55 ± 0.07b 0.38 ± 0.05bc 30.977＜0.001 p-ERK/ERK 0.84 ± 0.09 0.62 ± 0.09a 0.50 ± 0.05b 0.37 ± 0.04bc 47.163＜0.001 DNMT1/GAPDH 0.93 ± 0.11 0.75 ± 0.09a 0.49 ± 0.05b 0.36 ± 0.05bc 62.500＜0.001 POLD1/GAPDH 0.88 ± 0.10 0.73 ± 0.11a 0.48 ± 0.07b 0.34 ± 0.04bc 49.532＜0.001

图1 Western blot 检测各组HeLa 细胞中HSP90、p-ERK、ERK、DNMT1、POLD1 蛋白表达情况Fig.1 Western blot detect the HSP90，p-ERK，ERK，DNMT1，and POLD1 protein expression in HeLa cells of each groups

2.2 各组HeLa 细胞增殖情况顺铂组与对照组相比较，HeLa 细胞OD值降低（P＜0.05）；低浓度组与顺铂组相比较，HeLa 细胞OD 值显著降低（P＜0.05）；与低浓度组相比，高浓度组HeLa 细胞OD 值显著降低（P＜0.05），见表2。

2.3 各组HeLa 细胞凋亡情况与对照组相比，顺铂组HeLa 细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与顺铂组相比，低浓度组HeLa 细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与低浓度组相比，高浓度组HeLa 细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图2、表2。

图2 各组HeLa 细胞凋亡情况Fig.2 Apoptosis of HeLa cells in each groups

表2 各组HeLa 细胞OD 值比较Tab.2 Comparison of the OD values，apoptosis of HeLa Cells in each groups ±s

注：较对照组，aP ＜0.05；较顺铂组，bP ＜0.05；较低浓度组，cP ＜0.05

组别对照组顺铂组低浓度组高浓度组F 值P 值OD 值0.53 ± 0.07 0.40 ± 0.07a 0.30 ± 0.04b 0.20 ± 0.03bc 38.813＜0.001凋亡率（%）6.42 ± 0.94 12.63 ± 1.13a 21.95 ± 1.26b 37.86 ± 2.04bc 567.597＜0.001

2.4 各组HeLa 细胞中增殖、凋亡蛋白表达情况顺铂组与对照组相比，PCNA 蛋白水平显著降低，而Bax 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；低浓度组与顺铂组相比，PCNA 蛋白水平显著降低，Bax 蛋白显著水平升高（P＜0.05）；与低浓度组相比，高浓度组PCNA 蛋白水平显著降低，Bax 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图3、表3。

表3 各组HeLa 细胞中PCNA、Bax 蛋白表达水平比较Tab.3 Comparison of PCNA and Bax protein expression levels in HeLa cells of each groups ±s，n = 6

注：较对照组，aP ＜0.05；较顺铂组，bP ＜0.05；较低浓度组，cP ＜0.05

组别对照组顺铂组低浓度组高浓度组F 值P 值PCNA/GAPDH 0.85 ± 0.10 0.57 ± 0.10a 0.40 ± 0.07b 0.26 ± 0.06bc 54.288＜0.001 Bax/GAPDH 0.25 ± 0.05 0.43 ± 0.05a 0.74 ± 0.07b 0.92 ± 0.08bc 133.742＜0.001

图3 Western blot 检测各组HeLa 细胞中PCNA、Bax 蛋白表达情况Fig.3 Western blot detect the PCNA，and Baxprotein expression in HeLa cells of each groups

3 讨论

宫颈癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，在女性相关死亡原因中居第四位。化疗是常用于宫颈癌的辅助治疗方式，可影响细胞行为，有效减缓癌症发展，减小手术切除后复发概率，延长患者生存时间［10］。目前，顺铂是临床上常用于治疗宫颈癌等癌症的一线化疗药物，但其耐药性的出现易降低宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，导致患者治疗不理想［11］。手术切除作为临床治疗癌症的核心治疗方式，手术期的种种操作均可能是影响癌症预后的重要因素，如手术造成的创口会影响机体免疫，给遗留癌细胞存活、转移、增殖创造良好环境，影响患者预后，而有研究发现，麻醉药的正确使用能减少手术期间癌细胞转移风险，并促进癌细胞凋亡［12-13］。此外，由于癌细胞对化疗药物具有耐药性或药物本身敏感性不高，手术期间使用具有抗癌效果、能提高化疗敏感性的麻醉药，将有利于术后化疗有效清除残余癌细胞，提高患者预后。

右美托咪定是临床常用的麻醉辅助用药，具有镇静、止痛及保持血流动力学稳定效应，常用于癌症手术中［14］。此外，LIU 等［15］研究发现，DEX 可降低TNF-α、IL-6 分泌量，抑制肿瘤炎症微环境形成。王仕斌等［7］研究发现，右美托咪定能通过抑制PI3K/Akt 通路激活，进而抑制人宫颈癌Hela 细胞的增殖、侵袭、迁移行为，诱导Hela 细胞凋亡。CHI 等［16］研究发现，右美托咪定对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭亦具有抑制作用，其作用机制可能与抑制糖类抗原Tn 表达有关。然而，目前右美托咪定对宫颈癌顺铂敏感性的影响尚无研究，本研究采用顺铂、右美托咪定对人宫颈癌HeLa 细胞进行分组处理，以探究右美托咪定对宫颈癌的作用及可能作用机制，结果显示，与对照组相比，顺铂组HeLa 细胞OD 值及细胞增殖相关蛋白PCNA表达降低，细胞凋亡率与细胞凋亡家族成员促凋亡蛋白Bax 表达升高，验证了顺铂的抑癌作用。进一步研究显示，随着右美托咪定的添加及浓度的升高，顺铂处理下的HeLa 细胞OD 值及PCNA 蛋白水平进一步降低，细胞凋亡率与Bax 蛋白水平进一步升高，表明右美托咪定可增强HeLa 细胞对顺铂的敏感性，从而抑制HeLa 细胞增殖并诱导其凋亡，且该作用随浓度的升高而增强。

HSP90 是一组结构高度保守的蛋白质，是维持胞内蛋白构象稳定及功能正常所必需的分子伴侣，参与细胞稳态与应激反应调节，在肿瘤治疗中可降低肿瘤细胞对抗肿瘤药的敏感性［17-18］。ERK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的主要成员，介导生长、发育、分裂、死亡等多种细胞生理过程，在肿瘤细胞行为调节中发挥重要作用［19-20］。SUN 等［6］研究显示，受体相互作用蛋白激酶3 通过HSP90/ERK 途径调节DNA 修复，最终影响肿瘤的化学耐药性。ZHOU等［21］研究表明，磷酸甘油酸激酶1 通过触发HSP90/ERK 途径介导的子宫内膜癌的DNA 修复和甲基化来促进顺铂化学耐药性。以上研究表明，HSP90/ERK 通路是化疗发挥疗效的重要靶点。此外，本研究发现，顺铂组HeLa 细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白水平显著降低，表明顺铂可抑制HSP90/ERK 途径激活，导致下游DNA 甲基转移酶DNMT1、DNA 修复相关蛋白POLD1 表达减少［22-25］，DNA 甲基化、DNA 修复水平降低，进而影响HeLa 细胞的增殖与凋亡过程。而使用右美托咪定处理后，HeLa 细胞中HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1 蛋白水平进一步降低，且高浓度右美托咪定对HSP90、p-ERK/ERK、DNMT1、POLD1蛋白表达的抑制作用更明显，表明右美托咪定可增强顺铂对HSP90/ERK 途径的抑制作用，进一步降低DNA 甲基化、DNA 修复水平，增强HeLa 细胞的顺铂敏感性。

综上所述，本研究首次发现右美托咪定能增强HeLa 细胞的顺铂敏感性，抑制HeLa 细胞增殖并诱导其凋亡，其过程可能与抑制宫颈癌HeLa 细胞中HSP90/ERK 通路，降低细胞内DNA 甲基化、DNA 修复水平有关。但本研究仅在宫颈癌的一种细胞株中展开实验得出该结论，且因不少研究认为HSP90/ERK 通路介导肿瘤细胞化疗抵抗而未设置回复实验，故将HSP90/ERK 通路作为右美托咪定影响HeLa 细胞顺铂敏感性的途径不够充分，后续研究会进行改进。