补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学研究

王伟伟，欧志学，章晓云，李统

(1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.桂林市中医医院，广西 桂林 541002)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种常见的关节退行性疾病[1]，寻求安全有效的治疗方案具有重要意义。中医药治疗KOA具有较好的临床疗效，而且不良反应较少。补肾壮筋汤出自《伤科补要》，是临床治疗KOA肝肾亏虚证的常用方剂。但由于该方成分较为复杂，具体的作用机制尚未完全明确。为此，本研究采用网络药理学方法探讨了补肾壮筋汤治疗KOA的作用机制，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 补肾壮筋汤活性成分筛选及靶点预测利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)检索并筛选补肾壮筋汤组成药物“熟地黄”“青皮”“白芍”“茯苓”“山茱萸”“续断”“杜仲”“当归”“牛膝”的活性成分(筛选条件：口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18)；在中药分子机制的生物信息学分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)中检索补肾壮筋汤组成药物“五加皮”的活性成分，并按照Lipinski类药五原则进行筛选，即分子量<500、氢键供体数<5、氢键受体数<10、脂水分配系数<5、旋转键<10[2]。在PubChem中检索补肾壮筋汤活性成分的结构式，将结果导入Swiss TargetPrediction数据库检索活性成分对应的靶点，按照Probability≥0.7进行筛选，汇总筛选结果并去除重复项。

1.2 补肾壮筋汤治疗KOA靶点预测以“knee osteoarthritis”为关键词，在GeneCard数据库中检索KOA的靶点。将检索结果和筛选出的补肾壮筋汤靶点导入Bioinformatics & Evolutionary Genomics网站，将二者取交集，预测补肾壮筋汤治疗KOA的靶点。

1.3 补肾壮筋汤治疗KOA关键靶点筛选将筛选到的补肾壮筋汤治疗KOA的靶点基因导入String数据库，分析各靶点蛋白之间的相互作用情况，设置置信度>0.9，隐藏游离蛋白。将String数据库的分析结果导入Cytoscape3.7.2软件，构建补肾壮筋汤治疗KOA靶点蛋白互作网络，并利用该软件Network Analyzer工具中的MCODE插件筛选关键蛋白模块，设置度值=2、节点得分=0.2、最大深度=100。

1.4 补肾壮筋汤治疗KOA主要活性成分筛选先筛选出与补肾壮筋汤治疗KOA的作用靶点有关的活性成分，再将其与补肾壮筋汤治疗KOA的作用靶点、补肾壮筋汤组成中药一同输入Cytoscape3.7.2软件，构建补肾壮筋汤治疗KOA“中药-活性成分-靶点”网络，分析补肾壮筋汤治疗KOA的主要活性成分。

1.5 补肾壮筋汤治疗KOA靶点基因功能及信号通路分析将1.3中String数据库的靶点分析结果导入DAVID数据库，进行补肾壮筋汤治疗KOA靶点基因GO富集分析和KEGG富集分析。利用R3.6.2软件将富集分析结果可视化。

1.6 补肾壮筋汤治疗KOA主要活性成分与关键靶点分子对接取1.3和1.4筛选出的关键靶点和主要活性成分，运用Autodock vina1.1.2软件进行分子对接。通过PDB数据库搜索关键靶点的3D结构，并使用Pymol1.7.2.1软件对其进行预处理，即使用盒子对蛋白进行定位，并对蛋白结构进行残基修补、去除水分子、添加氢原子和电荷，以PDBQT格式保存。通过PubChem数据库下载主要活性成分的结构，并基于MMFF94力场对其进行优化。以原配体所在位点作为关键靶点的活性口袋，进行主要活性成分和关键靶点的分子对接。选取结合能较好的分子对接结果，通过Protein-Ligand Interaction网站和Pymol1.7.2.1软件进行可视化。

2 结 果

2.1 补肾壮筋汤活性成分筛选及靶点预测结果在TCMSP和BATMAN-TCM共筛选到补肾壮筋汤的活性成分99个，预测到对应的靶点768个(表1)。

表1 补肾壮筋汤的活性成分及靶点数量

2.2 补肾壮筋汤治疗KOA靶点预测结果共筛选到KOA的靶点989个，将其与768个补肾壮筋汤靶点取交集后得到172个共同靶点，即补肾壮筋汤治疗KOA的靶点。

2.3 补肾壮筋汤治疗KOA关键靶点筛选结果将172个靶点基因导入String数据库分析后得到148个节点(即148个靶点基因)、490对蛋白互作关系，构建的补肾壮筋汤治疗KOA靶点蛋白互作网络见图1。通过MCODE插件筛选到1个包含15个靶点的关键蛋白模块(图2)，这些靶点即为补肾壮筋汤治疗KOA的关键靶点，分别为促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase ，MAPK)1、Akt激酶(akt kinase，AKT)1、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)、Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(harvey rat sarcoma virus oncogene homolog，HRAS)、MAPK8、白细胞介素(interleukin，IL)-6、激肽原1(kininogen 1，KNG1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、热激蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，HSP90AA1)、JUN原癌基因(JUN proto-oncogene，JUN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、MAPK14、IL-2、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，F2)。

图1 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎的靶点蛋白互作网络

图2 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎的靶点蛋白

2.4 补肾壮筋汤治疗KOA主要活性成分筛选结果补肾壮筋汤99个活性成分中与补肾壮筋汤治疗KOA的靶点有关的活性成分共64个(表2)。构建的补肾壮筋汤治疗KOA“中药-活性成分-靶点”网络(图3)显示，度值前5位的活性成分，即补肾壮筋汤治疗KOA的主要活性成分分别为汉黄芩素(wogonin)、啤酒甾醇(cerevisterol)、槲皮素(quercetin)、黄芩素(baicalein)、山奈酚(kaempferol)。

表2 补肾壮筋汤的部分活性成分

续表2

图3 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎“中药-活性成分-靶点”网络图

2.5 补肾壮筋汤治疗KOA靶点基因功能及信号通路分析结果将String数据库分析后得到的148个靶点上传至DAVID数据库。GO富集分析(图4)共得到684个条目，其中细胞组分64个、生物过程516个、分子功能104个，生物过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、凋亡过程的负调控、信号传导、调控细胞增殖、转录等，分子功能主要涉及蛋白质结合、ATP结合、锌离子结合、相同蛋白质结合、酶结合等，细胞组分主要涉及细胞内质膜、细胞质、细胞核、胞质溶胶、核质等。KEGG富集分析(图5)共得到111条通路，排除与KOA联系不够密切的通路，共筛选出磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT、MAPK、TNF等3条主要信号通路。

图4 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎靶点基因GO富集分析柱状图(前10位)

图5 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎靶点基因KEGG富集分析气泡图(前20位)

2.6 补肾壮筋汤治疗KOA主要活性成分与关键靶点分子对接结果分子对接结果显示，5个主要活性成分与15个关键靶点均有良好的结合能力，结合能均≤-5.0 kJ·mol-1(表3)。取每个主要活性成分与关键靶点结合能最好的组合进行可视化，分子对接图显示活性成分大多嵌入靶点活性口袋的疏水区，结合模式多以π-π作用和氢键为主，提示其具有较好的结合活性，结合后构象稳定(图6)。

表3 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎主要活性成分与关键靶点的结合能 单位：kJ·mol-1

图6 补肾壮筋汤治疗膝骨关节炎的主要活性成分与关键靶点分子对接图

3 讨 论

从本研究的结果来看，汉黄芩素、啤酒甾醇、槲皮素、黄芩素、山奈酚为补肾壮筋汤治疗KOA的主要活性成分。相关研究表明，汉黄芩素能抑制人软骨细胞中NO、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎症因子的表达，同时诱导核因子E2相关因子2转位至细胞核，与抗氧化反应元件结合，发挥抗氧化作用[3]。啤酒甾醇是从内生真菌乙酸乙酯提取物中分离出的一种活性化合物[4]，能阻断脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶2表达上调，抑制其发挥免疫抑制作用，以及抑制NO、PGE2等炎症因子的释放[5]。槲皮素则具有抗氧化应激、抗炎等作用[6]，可降低基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)以及IL-1β等细胞因子的表达，从而抑制细胞外基质的降解来保护关节软骨[7]。作为黄芩主要活性成分之一的黄芪素，目前已被相关研究证实具有抗病毒、抗氧化、抗炎以及镇痛等作用[8-9]。杨波等[10]通过实验发现，黄芩素可通过调节miR-29a-3p来抑制MAPK6磷酸化，从而抑制软骨细胞退化。山奈酚是一种存在于绿茶、浆果及一些中草药中的膳食类黄酮[11]，能抑制TNF、IL-1、IL-6基因表达和对应炎症因子分泌[12]。

对于靶点的分析表明，MAPK1、AKT1、APP、HRAS、MAPK8、IL-6、KNG1、VEGFA、HSP90AA1、JUN、TNF、MAPK14、IL-2、EGFR、F2等15个靶点为补肾壮筋汤治疗KOA的关键靶点。而靶点基因富集分析结果表明，MAPK1、AKT1、HRAS都与PI3K-AKT和MAPK这2条关键信号通路有关。MAPK1参与多种细胞过程，如增殖、分化和凋亡等。相关研究显示，增加MAPK1的表达，可减弱IL-1β诱导的软骨细胞炎症损伤[13]。AKT在转化生长因子β的调控下可发生磷酸化，诱导组织金属蛋白酶抑制因子3表达，增强细胞外基质强度[14]。HRAS是RAS基因家族成员之一，负责调控细胞的生长与分裂[15]。HRAS多见于癌症研究当中[16]，其在KOA中作用的报道较少。Lü等[17]在轻度的OA组织中观察到HRAS表达下调，以及Ⅱ型胶原蛋白和MMP-13表达下调。Jiang等[18]的研究结果显示，HRAS敲减可减弱miR-218-5p抑制对TNF诱导的软骨细胞功能障碍的保护作用。因此，后续的相关研究可基于MAPK1、AKT1等核心靶点进行实验设计，也可将HRAS作为研究补肾壮筋汤治疗KOA细胞机制的新方向。

本次研究中对靶点基因的富集分析结果发现，补肾壮筋汤治疗KOA的大部分关键靶点与PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路有关。PI3K-AKT信号通路主要参与细胞增殖、凋亡以及分化，目前也被认为是调控软骨细胞凋亡的最重要的信号通路之一。PI3K被激活后产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸，后者与细胞内AKT结合后促使下游因子磷酸化，调节细胞功能[19]。颜春鲁等[20]研究发现，右归丸能有效抑制KOA模型大鼠软骨组织中PI3K、pAKT等相关蛋白表达，促进细胞自噬以阻止软骨细胞进一步退化；同时还发现，右归丸能通过调控PI3K-AKT信号通路来抑制KOA患者的炎症反应及软骨细胞外基质的过度降解，从而延缓关节软骨退变。MAPK广泛存在于真核细胞当中[21]，作为MAPK信号通路三大亚类之一的p38MAPK信号通路，与KOA的病情进展关系密切。谢文鹏等[22]通过动物实验发现，存在炎症的软骨基质中，p38MAPK通路中的TNF、IL-1β等炎症因子的分泌可被苍膝通痹胶囊抑制，同时该药还抑制了MMP-3、MMP-13的表达，进而抑制Ⅱ型胶原蛋白的降解以保护关节软骨。

本研究的结果提示，补肾壮筋汤治疗KOA的作用机制可能是通过汉黄芩素、啤酒甾醇、槲皮素、黄芩素、山奈酚等活性成分，参与调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、凋亡过程、信号传导、细胞增殖、转录，影响PI3K-AKT、MAPK、TNF等信号通路。受条件限制，本研究未能将分析结果与方剂配伍、药物配比及药物剂量等具体问题相联系。本研究得出的补肾壮筋汤的主要活性成分槲皮素和山奈酚，也见于其他骨科方药的活性成分研究结果中，这可能与数据库信息收集的局限性有关。