热休克蛋白90α在活动性肺结核患者血液中的表达研究
2022-10-19刘佳星查晓丹戚应杰
李 烨,刘佳星,岳 莉,查晓丹,戚应杰
(安徽省立医院感染病院检验科,安徽合肥 230000)
结核病是由结核分枝杆菌引发的慢性感染性疾病,是自2007年来传染病致死的主要原因,以肺结核最为常见,并且明显有逐年增加之势,但是对于其早期的诊断至今仍较为困难。根据《肺结核诊断WS 288-2017》规定,肺结核的实验室检查有病原学检查(包括微生物学和分子生物学检查)、结核病病理学检查、免疫学检查及支气管镜检查,但均有一定的局限性,如结核菌素试验不能排除接种卡介苗的影响,γ-干扰素释放实验在活动性肺结核(ATB)、潜伏性结核(LTBI)的诊断中特异度不高等[1]。故对其优化和改良是目前TB检测研究的重要方向。近些年随着蛋白质组学和基因组学的发展,一些新的结核病实验室诊断项目也逐步应用于临床。热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一种健康状态下,在原核和真核生物中广泛分布的蛋白质。根据已有的研究报告显示,在特定的生理及病理状态下,比如细胞内环境的变化—胞内细菌感染如结核分枝杆菌感染[2],胞内寄生虫感染如恶性疟原虫感染等情况下,均可诱发热休克蛋白基因的表达[3]。根据其相对分子质量的不同可分为五大类,其中,HSP90在细胞中含量丰富,分布于大部分细菌中;根据来源和亚细胞定位HSP90可分为四种异构体,其中位于细胞质内的Hsp90α主要参与快速反应,如应激等[4-7]。本文旨在研究Hsp90α在ATB患者和LTBI患者血液中的表达差异及其是否能够作为一种区别二者的新的生物标志物。
1 资料与方法
1.1 一般资料选取2021年1月至6月在安徽省立医院感染病院就诊的结核分枝杆菌感染患者146例为观察组,其中ATB组81例记为活动组,LTIB组65例记为潜伏组。其中,活动组男性50例,女性31例;年龄18~86岁,平均年龄(54.47±4.61)岁。 潜伏组男性37例,女性28例,年龄17~87岁,平均年龄(53.38±5.06)岁。两组各项一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有参与研究的患者均签署知情同意书并获得安徽省立医院感染病院医学伦理委员会的批准。诊断标准:ATB诊断标准[8]:活动性肺结核诊断参考《肺结核诊断标准(WS288—2017)》,具有典型的胸部影像学特征和临床表现,同时经病原学(包括细菌学和分子生物学)或者组织病理学证实。LTBI诊断标准[9]:感染者无ATB感染的临床表现也无胸部影像学特征,结核菌素皮试(tuberculin skin test,TST)及γ-干扰素释放试验(interferon-γ release assay,IGRA)呈阳性反应判断者。纳入标准:符合上述诊断标准者。排除标准:①合并肿瘤;②妊娠期患者;③合并自身免疫性疾病。
1.2 检验方法仪器与试剂:Hsp90仪定量检测试剂盒(烟台普罗吉生物科技发展有限公司),EDTA-K2抗凝管;肝素抗凝管;结核分枝杆菌特异度细胞免疫反应检测试剂盒(广东希格生物科技有限公司)
试验:所有试验按照说明书进行。结果判读标准:Hsp90α定量检测:Hsp90α正常值<82 ng/mL。 T细胞酶联免疫斑点试验(T-spot.TB)结果判读:阴性对照测孔斑点数<10个,且实验孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥11,结果判读为阳性;阴性对照孔斑点数为11~20个时,测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数>阴性对照孔斑点数,结果判读为阳性。若上述标准不符合且阳性对照孔斑点数正常时,结果为阴性。无效结果:当阴性对照空斑点数>20时,结果无效。
1.3 观察指标①两组Hsp90α、T-spot斑点数比较。②血浆Hsp90α和T-spot斑点数在辅助诊断ATB中的价值。
1.4 统计学分析数据分析及ROC曲线均采用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计量资料为非正态分布,ATB组、LTBI组及非结核类肺疾病组的Hsp90α水平和T-spots斑点数用以中位数(上下四分位数)[M(P25,P75)]表示,数据分析前先以 Kolmogorov-Smimov 检验判断各组数据是否符合正态分布规律,两组间比较采用Mann-Whitney U检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者的Hsp90α、T-spot斑点数比较两组Hsp90α水平和T-spot斑点数分别比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。其斑点图比较见图1、 图2。
图1 活动性肺结核、潜伏型肺结核患者Hsp90α水平比较
图2 活动性肺结核、潜伏性肺结核患者T-spot.TB细斑点点数比较
表1 三组Hsp90α、T-spot斑点数比较
2.2 血浆Hsp90α和T-spot斑点数在辅助诊断ATB中的价值根据ROC曲线可得,Hsp90α辅助诊断ATB的临界值为81.5 ng/mL,在此处对应的敏感度为74.1%,特异度为81.8%,ROC曲线下面积为0.745(95%CI:66.4%~82.6%),见图3。而T-spot.TB辅助诊断ATB的临界值为43.5,在此处所对应的敏感度为40.7%,特异度为84.4%,ROC曲线下面积为0.624(95%CI:0.536~0.712),见图4。
图3 活动组和潜伏组的Hsp90αROC曲线图
图4 活动组和潜伏组的T-spot斑点数ROC曲线图
3 讨论
WHO《2020年全球结核病报告》[10]中通报了2019年全球结核病新发病例996万例,死亡病例110万例,其中中国约83.3万例,占全球结核病例数的8.4%,居全球第三位。新发肺结核病例主要由LTBI患者发展而来,其中5%~10%的LTBI进展为ATB。T-spot.TB是目前结核特异度刺激抗原的T细胞IFN-γ释放分析诊断结核感染的最主要方法,但研究显示,T-spot.TB虽然在检测肺结核方面有很大的价值,但它不能区分肺结核是活动性的、陈旧性的还是潜伏性的,它的阴性结果相对而言在排除结核病方面意义更大[11]。此外,T-spot.TB结果的解释受多种因素影响,包括诊断标准、既往结核病史、非结核分枝杆菌感染、年龄和病灶位置。其诊断结核病的敏感度及特异度在不同的研究中结果差异也较大[12]。而从本次研究结果可以看出,Hsp90α定量检测在区分ATB和LTBI的敏感度上要远高于T-spot.TB而特异度略低,说明当Hsp90α值升高时对辅助诊断ATB的意义更大。
本次研究着重在于分析Hsp90α在ATB患者血液中的表达,从上述结果可以看出,外周血血浆中Hsp90α在ATB患者中的表达水平要远高于LTBI患者患者,其中位数及整体分布水平相差较大,且在活动期水平较高;而T-spot.TB斑点数从分布可以看出,TB虽然中位数水平要高于LTBI,但是两组有大量重叠的部分,仅依靠斑点数的高低来区分ATB和LTBI仍然较为困难;进一步的ROC曲线分析显示,以Hsp90α在血液中的表达水平来诊断ATB具有较高的敏感度和特异度。国外研究者发现宿主(Hsp25、Hsp60、Hsp70和Hsp90)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Hsp(s)(Hsp16、Hsp65和Hsp71)是人类TB患者肺内外临床样本中MTB 感染的单核细胞中免疫反应的重要特征。值得注意的是,宿主(Hsp25、Hsp70和Hsp90)和MTB(Hsp16、Hsp65和Hsp71)Hsp(s)在 临床样本和TB感染后的细胞系模型中显著增加[13]。Shekhawat等发现,Hsp90在诊断结核性脑膜炎上的敏感度和特异度达到88%和89%,阳性预测值为89.36%(76.88-96.41),阴性预测值为91.36%(82.99~96.44)[14]。在86%的结核性脑膜炎(TBM)患者血液中的Hsp90都被发现为阳性。Hsp90显示出良好的敏感度和特异度,并具有诊断TBM疾病的潜力。与高风险暴露组、低风险暴露组和低风险暴露组相比,活动性结核病组中宿主Hsp90水平显著升高(P<0.05)[15],这也与本次研究结果较为一致。从实验方法上来说,检测Hsp90α所使用的酶联免疫法(ELISA)法简单快速,价格也较为低廉,较容易普及;而与传统的T-spot.TB相比,Hsp90α诊断ATB具有更高的敏感度。本研究所纳入的患者数量有限,且未对患者进行跟踪研究,因此数据具有一定的局限性,所得结论仍需要在更大样本中进行验证。在后续研究中还需要继续探讨Hsp90α与T-spot.TB联合应用对于诊断结核病及区分ATB和LTBI的意义及Hsp90α随着病程发展在血液中的动态变化,以便更好地监测ATB的发生发展。
综上所述,结核分枝杆菌所导致的肺结核会引起机体Hsp90α表达上调,Hsp90α在辅助诊断ATB和排除已知诱导其产生的疾病因素(如肿瘤和癌症)方面具有相当大的价值。临床检测结核分枝杆菌感染期间外周血中 Hsp90α水平的变化对于进一步分析、讨论以及制定ATB和LTBI患者预防和治疗策略有较为重要的意义。