春化基因 Vrn-1对二系杂交小麦亲本抽穗期的作用研究

陈现朝，廖祥政，高建刚，杨卫兵，侯起岭，刘江峰，张风廷，张胜全

(北京市农林科学院杂交小麦研究所，北京 100097)

杂交小麦具有提高小麦产量的潜力。二系杂交小麦是利用光温敏不育系和恢复系杂交，在产量、抗逆性等性状上均优于亲本或对照品种的杂交小麦品种。小麦杂交种往往需要外源小麦花粉进行制种，自花授粉的小麦因制种亲本花期不遇或株高差异等问题，导致制种产量低且不稳定。这是限制二系杂交小麦品种走向市场的主要因素之一。研究表明，制种亲本抽穗期差异较大，是导致制种产量不稳定的主要因素之一。研究遗传和环境因素对二系杂交小麦亲本抽穗期的作用，筛选抽穗期稳定的材料并通过播期协调其发育进程，对于稳定二系杂交小麦的制种产量具有重要的意义。

与小麦抽穗期相关的基因有春化基因()、光周期基因()和早熟基因()。迄今为止，已有多个研究利用 PCR 扩增技术和凝胶电泳技术对春化基因、光周期基因在小麦中的组成和分布进行了检测，并对春化基因和光周期基因在小麦抽穗期的作用进行了研究，结果表明，春化基因和光周期基因的组成、分布与品种特性和生态区域相适应；但部分研究因种植区域不同，基因效应有所差异。Padovan等研究了基因、环境和播期对地中海地区硬粒小麦产量的作用，提出不同区域应选择适宜的品种及配套播期等栽培措施来提高产量。Kiss等通过 2011 年秋播和 2012 年春播，对不同播期的小麦抽穗期进行了研究，发现小麦抽穗期与光周期基因相关，而春化基因对小麦抽穗期的作用不显著。但春化基因对抽穗期的作用，需在不同环境或多年试验条件下进一步验证。2016年Rasheed等基于春化基因的STS标记开发了KASP标记，并对国内外小麦品种的分布及其对抽穗期的作用进行了检测。与STS标记相比，KASP 标记对基因组SNP 位点的变异检测更为简便高效，且成本较低，因此成为种质资源评价和筛选的主要技术手段。但利用KASP标记对二系杂交小麦抽穗期稳定性的研究却鲜有报道。

本研究以34份不育系和96份恢复系为试验材料，利用春化基因的7个KASP功能标记，对其在不育系和恢复系的组成和分布进行检测。并于2018-2019和2019-2020两个年度种植在河南邓州，以播种至抽穗的日历日和生长度日为指标，研究春化基因对二系杂交小麦亲本抽穗期的作用，分析携带不同等位基因亲本的抽穗期稳定性，以期获得抽穗期稳定的材料，为获得制种产量稳定的二系杂交小麦亲本组合提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018-2019和 2019-2020 两个年度在北京市农林科学院河南邓州杂交小麦产业化试验基地(32.68°N，112.08°E)进行。供试材料共 130 份，其中二系杂交小麦骨干光温敏不育系 34 份(在邓州地区常年10月25日播种，不育度大于95%)，骨干恢复系 96 份(其中12份为外部引进品种，84份为本研究所改良的高恢复力材料)。

1.2 试验方法

1.2.1 田间试验设计及表型调查

2018年和2019年，34份不育系分别于10月13日和10月19日播种，96份恢复系分别于10月19日和10月27日播种。每个材料种植2行，每行30粒，行长1.5 m，行距25 cm。采用随机区组设计，2个重复。施用小麦专用复合肥(N∶P∶K为 25∶14∶7)，化肥全部基施，按照一般大田管理技术进行管理。参照宋彦霞等的方法对抽穗期进行田间调查。播种至抽穗的日期为抽穗期的日历日。

1.2.2 春化基因的检测

参考Rasheed等报道的7个KASP标记(Vrn-A1_9K0001、Vrn1_new、Vrn-A1b-Marq、Exon7_C/T_ Vrn-A1、Vrn-B1_A、Vrn-B1_B和Vrn-D1-D1a_A)对春化基因进行检测。具体引物序列信息如表1所示。根据KASP技术的要求，FAM引物5′端加上特异性接头GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，HEX引物5′端加上特异性接头GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。于小麦返青期，剪取小麦叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)提取基因组DNA，浓度在10～30 ng·μL之间。以基因组DNA为模板，分别用7对KASP标记引物进行PCR扩增。PCR反应体系为10 μL，包括cDNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，南京)5 μL，ddHO 3.6 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性20 s，61～55 ℃退火(选用Touchdown程序，每个循环降低0.6 ℃)1 min，扩增10个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃延伸 1 min，继续扩增26个循环。待PCR扩增产物温度降至40 ℃ 以下时，通过酶标仪FAM、HEX光束扫描读取荧光值，用LGC公司开发的SNP viewer 2.0软件读取检测数据。试验结果剔除杂合和缺失位点样本，用Excel统计不育系和恢复系材料中、和位点等位基因的分布频率。

表1 检测 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1等位基因所用的引物信息

1.2.3 温度信息的采集

1.3 数据处理

用Microsoft Excel 2019对数据进行整理，用SPSS 25.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1的组成及分布

结果(表2)发现，供试材料以冬性材料为主。7个标记 Vrn-A1_9K0001、Vrn1_new、Vrn-A1b-Marq、Exon7_C/T_Vrn-A1、Vrn-B1_A、Vrn-B1_B和Vrn-D1-D1a_A在供试材料中主要检测到5个等位基因。除了未检测出目的条带的材料外，、2147 type、、Hereward-type 是不育系和恢复系中的主要等位基因类型，分布频率分别为 88.24%和84.38%、44.12%和54.17%、88.24%和28.13%、82.35%和 92.70%；是不育系和恢复系中的主要等位基因类型，分布频率分别为 52.94% 和 61.45%。由表3可知，供试材料包含39种春化基因型，其中1号、3号、4号、5号、7号、9号、10号、13号、18号基因型在不育系和恢复系均存在，分别占不育系和恢复系的76.48%和46.87%。

表2 Vrn-A1、 Vrn-B1和 Vrn-D1基因在不育系和恢复系中的组成和分布频率

2.2 播期和春化基因 Vrn-1对二系杂交小麦亲本抽穗期的影响

由表3可知，1号、3号、4号和5号四个基因型在供试材料中的分布频率较大。因此，本研究以1号、3号、4号和5号四个基因型的不育系和恢复系为研究对象，以播种至抽穗的日历日和生长度日为指标，研究播期和春化基因对不育系和恢复系抽穗期的作用。对供试材料2018-2019和2019-2020两个年度播种至抽穗的日历日和生长度日进行显著性比较分析，从表4 可以看出，两个年度不育系和恢复系间播种至抽穗的生长度日差异均达到极显著水平，但播种至抽穗的日历日因年度变化而不同；其中2018-2019年度不育系和恢复系间差异极显著，2019-2020年差异不显著。

表3 Vrn-A1、 Vrn-B1 和 Vrn-D1 基因型的组成和分布频率

表4 不育系和恢复系播种至抽穗的日历日和生长度日显著性比较

为进一步阐明不同基因型亲本的抽穗期稳定性，选择1号、3号、4号和5号四个基因型的不育系和恢复系为材料，在2018-2019和2019-2020两个年度对不育系和恢复系组合间播种至抽穗的日历日和生长度日进行显著性比较分析，结果(表 5)表明，1号、3号、4号和5号四个基因型的不育系和恢复系组合间播种至抽穗的日历日差值和生长度日差值因组合不同而表现不同。且不育系和恢复系在不同组合间和不同年度间播种至抽穗的日历日差值不稳定。对不育系和恢复系组合间生长度日差值而言，组合“3号×3号”、“3号×4号”在两个年度间的稳定性较好，2018-2019和 2019-2020两个年度播种至抽穗的生长度日差值分别为-96.3和-90.3 ℃·d、-118.9和-122.0 ℃·d，差异达极显著水平；组合“5号×4号”在两个年度播种至抽穗的生长度日差值稳定性最差，2018-2019和 2019-2020两个年度分别为-110.7和-84.0 ℃·d，差异达极显著和显著水平。

表5 不育系和恢复系不同基因型组合播种至抽穗的日历日差异和生长度日差异

3 讨 论

3.1 小麦春化基因 Vrn-1的组成和分布

明确二系杂交小麦亲本春化基因的组成和分布，可为其在制种产量稳定性方面奠定基础。Zhang等对春化基因、、和在不同麦区的组成及分布进行了研究，发现显性等位基因的分布频率自北向南逐渐增加，其中在黄淮冬麦区的分布频率为36.1%，而在长江中下游冬麦区和西南麦区的分布频率为64.1%，且仅含有春化显性等位基因；隐性等位基因在华北平原冬麦区的分布频率为100%，在黄淮麦区也有分布。本研究结果表明，二系杂交小麦骨干亲本春化基因以显性基因型为主，占比80%以上，该结果比Zhang等的研究结果(53.0%)有所提高，这可能与材料来源不同有关。本研究供试材料群体春化基因变异较少，且主效等位基因几乎无变异。这可能与二系杂交小麦不育系在北京(可育)、邓州(不育)两地进行穿梭育种有关，供试材料经过人工定向选育和两种自然环境双重选择压力，群体春化基因变异较小。

3.2 小麦春化基因 Vrn-1在小麦抽穗期的作用

小麦发育既受春化和光周期基因调控，也受光照和温度影响。Zhang等发现，携带的小麦材料抽穗期最早，携带和的材料次之。本研究供试材料不育系和恢复系组合“3号×4号”在2018-2019和2019-2020两个年度中的稳定性较好，原因可能是组合“3号×4号”在和位点的等位基因存在差异，而在位点上相同。因此，为筛选抽穗期稳定的小麦，应进一步通过分子标记辅助鉴定并筛选不育系和恢复系春化基因型组合“3号×4号”的小麦进行制种。

此外，由于本研究仅基于基因的KASP标记对二系杂交小麦亲本抽穗期的作用进行研究。未能分析其他春化基因、光周期基因或早熟基因对二系杂交小麦亲本抽穗期的作用。因此，下一步应结合STS标记研究其他春化基因(如)和光周期基因的等位基因组合对二系杂交小麦亲本抽穗期的作用。

3.3 抽穗期与生长度日的关系

小麦生长发育需要的积温相对稳定，但由于年度间或不同播期小麦发育进程温度变化不稳定和光照时长的差异，以小麦播种至抽穗的日历日为小麦发育进程的指标不够准确。本研究比较携带不同春化基因型的小麦播种至抽穗的日历日差异和生长度日差异，发现携带相同春化基因型的小麦播种至抽穗的生长度日较日历日更稳定。同时，由于小麦发育阶段的基础温度因品种或发育阶段有所不同，本研究利用0 ℃作为小麦播种至抽穗的基础温度不够准确，导致不同基因型小麦播种至抽穗的生长度日在年度间有所变动。

综上所述，以小麦生长度日为播种至抽穗的指标，以春化基因的KASP功能标记辅助筛选到不育系和恢复系春化基因型组合为“3号×4号”且抽穗期稳定的材料，并结合邓州地区光温特性调整播期以协调其发育进程，为稳定并提高二系杂交小麦制种产量提供科学依据。