脊柱结核患者外周血TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平及临床意义

李树根,冯大雄，汪在德，刘志强

脊柱是骨关节结核的主要发病部位，脊柱结核具有发病隐匿的特点，患者就医时通常已发展至中晚期，出现脊柱失稳、畸形、瘫痪等症状[1]。目前，临床治疗脊柱结核的主要方法为手术治疗加抗结核的综合疗法，但患者存在难治、术后结核复发、耐药等情况，使脊柱结核防治受限[2]。因此，临床需对脊柱结核患者复发的相关因素进行深入研究，根据便于获取、且较可靠的指标对脊柱结核复发进行预测。Toll样受体(TLRs)是机体先天性免疫系统中的细胞跨膜受体及病原模式识别受体之一，临床关于骨关节结核及其易感因素的研究主要集中于TLRs信号正反馈传导通路[3]。有研究表明，肺结核患者外周血中白细胞介素-17(IL-17)表达水平高于正常对照组，提示IL-17可能参与结核的病理过程[4]。Toll作用蛋白(Tollip)在发挥作用时需与Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)结合来产生对TLR相关应答的抑制作用[5]。本研究旨在探究脊柱结核患者外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平及临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2020年1—12月我院收治的脊柱结核96例的临床资料。纳入标准：经影像学检查、病理检查确诊为脊柱结核[6]者；年龄>18岁者；未接受抗结核治疗或手术治疗者。排除标准：临床资料缺失者；合并恶性肿瘤者；合并心脑血管疾病者；合并骨代谢疾病者，如骨质疏松症、遗传性骨病等；合并其他部位感染者；合并自身免疫性疾病者；合并肺部或其他部位活动性结核者；需长期使用影响免疫功能的药物者。将96例脊柱结核作为观察组，选择同期来我院进行体检的健康者40例作为对照组，2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 采集2组清晨空腹外周静脉血6 ml，将采集的血液置于EDTA抗凝管中，并于-80 ℃低温冷冻保存。取静脉血2 ml，按照全血RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA，使用紫外分光光度计测定RNA含量。按照反转录试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA。将逆转录产物使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法获取TLR4、IL-17及Tollip mRNA的扩增曲线并使用2-ΔΔCt计算各样本中的mRNA含量，ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。

1.3观察指标 检测并分析2组受试者外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量，使用受试者工作特征(ROC)曲线分析外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量表达对脊柱结核患者的诊断效能。观察组均随访1年，根据观察组患者是否复发分为未复发组(n=68)及复发组(n=28)，分析2组外周血TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量表达差异，使用ROC曲线分析外周血TLR4、IL-17、Tollip mRNA含量表达对脊柱结核复发的预测效能。

2 结果

2.1外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平比较 观察组外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平均高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 2组外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平比较

2.2外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者的诊断效能 ROC曲线分析结果显示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者的诊断效能均较高(P<0.05)。见表2、图1。

表2 外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者的诊断效能分析

2.3未复发组与复发组外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平比较 复发组外周血中TLR4、IL-17、Tollip mRNA水平均高于未复发组(P<0.01)。见表3。

表3 未复发组与复发组外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平比较

2.4外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者复发的预测效能 ROC曲线分析结果显示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者复发的预测效能均较高(P<0.05)。见表4、图2。

表4 外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者复发的预测效能分析

3 讨论

结核杆菌可侵犯绝大部分人体组织，其中肺外结核多见于骨及关节部位，而脊柱是主要的肺外结核发病部位[7]。脊柱结核早期病变常发生于椎体前下部，随着病程进展逐渐累及椎体中心部位和椎间盘，当患者椎间盘发生破坏、塌陷后可导致脊髓压迫，甚至截瘫等严重后果[8]。TLRs属Ⅰ型跨膜蛋白，可参与病原微生物及其产物的识别，其可将细胞外区域识别的信息传导至通路下游[9]。正常情况下，人体组织的TLRs表达水平较低，当机体受到感染，TLRs通路被激活后，则TLRs表达水平会显著升高，且会促进炎性因子分泌[10]。IL-17是CD4+ T淋巴细胞亚群Th17分泌的细胞因子，其可增强T淋巴细胞分化，刺激成纤维细胞、巨噬细胞等细胞产生炎性介质及趋化因子，导致炎症[11]。Tollip基因可维持机体正常免疫系统的平衡，且对机体感染后的TLRs信号转导通路有调节作用[12]。本研究结果显示，脊柱结核患者外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平高于健康者，其机制可能为患者受到结核杆菌感染后，TLR4信号通路激活产生免疫应答，使大量炎性因子释放，导致免疫应答紊乱、炎症增强、组织坏死。既往有研究认为，感染结核杆菌的患者体内TLR4、Tollip均处于异常水平[13]。近年来研究发现，IL-17参与了脊柱结核患者的免疫应答，且在脊柱结核病灶的形成、病情进展中均发挥作用[14]。本研究ROC曲线分析结果显示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者的诊断效能均较高。

TLR4主要存在于单核细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞表面，其信号通路在抗结核杆菌的免疫应答、遗传易感性、诊疗方面均有重要作用[15]。IL-17参与了结核病患者抗感染免疫的介导过程，对促进中性粒细胞生成和募集、加强干扰素-γ的保护性反应、促进肉芽肿形成均有较显著的作用[16]。目前临床认为，Tollip不仅通过TLR信号发挥抗炎作用，还可影响免疫细胞功能、参与细胞凋亡，而Tollip mRNA缺乏则可能使患者结核感染的风险提高[17]。本研究结果显示，复发组外周血中TLR4、IL-17及Tollip mRNA水平均高于未复发组，提示TLR4、IL-17及Tollip mRNA可能参与脊柱结核的复发。此外，本研究ROC曲线分析显示，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平对脊柱结核患者复发的预测效能均较高，说明上述指标均对预测脊柱结核患者复发有一定意义。

综上所述，外周血TLR4、IL-17及Tollip mRNA表达水平可用于诊断脊柱结核，且对预测患者是否复发有一定价值。