UFLC-MS/MS法分析蜈蚣中3种多肽成分以及在蜈蚣鉴别中的应用

李彦超,胡靓君,张琪,刘睿,崔小兵,柴川,文红梅

(南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

《中国药典》(以下简称“药典”)收载的蜈蚣为蜈蚣科少棘巨蜈蚣ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch的干燥体[1],性辛、温,有毒。其始载于《神农本草经》,被列为下品,具有息风镇痉,攻毒散结,通络止痛之功效。由于其性猛力强,疗效远超其他平性中药,被历代医家所喜用。

我国蜈蚣资源种类较多,分布较广,目前药用蜈蚣多来源于野生,除药典规定的正品药用蜈蚣少棘巨蜈蚣外,还有多棘蜈蚣S.subspinipesmultidensNewport、墨江蜈蚣S.mojiangicaZhang et Chi、黑头蜈蚣S.negrocapitisZhang et Wang和哈氏蜈蚣S.hedaaniBrandat这4种常见品种,在某些地区的民间也作为药用蜈蚣使用,存在着混用误用现象[2]。不同品种蜈蚣在产地、形态及功效等方面存在差异。少棘巨蜈蚣主要分布在长江中下游地区,其头板及第一背板桔红色,其他背板深绿色,体型小,主治肝风内动,痉挛抽搐,小儿惊风,风湿顽痹,蛇虫咬伤等;多棘蜈蚣主要分布在云南、广西等地,头板及第一背板红褐色,其他背板棕色,体型大,内服或外用,用于惊风、抽搐、淋巴结核、肿毒疮疡、肿瘤等;墨江蜈蚣主要分布在云南墨江地区,暗褐色,体型小,内服,用于中风、风湿、疮疡、瘰疬等;黑头蜈蚣分布在长江流域,青绿色,体型小,有时混于少棘巨蜈蚣药材商品中;哈氏蜈蚣主要分布在珠江流域,云南、海南等地,头板及第一背板红棕色,其他背板棕色或黄棕色至红棕色,泡酒外用,用于风湿、癣疥等[3]。

蜈蚣中蛋白质和多肽成分含量占60%～70%[4],为抗肿瘤[5-7]、抗凝、溶栓[8-9]和抗菌[10-13]等作用的有效成分,但由于蛋白多肽类成分复杂,缺乏针对蜈蚣蛋白多肽类成分的特异性鉴别。基于生物质谱的分析方法已被应用于不同物种的鉴别,如梁瑞强等[14]找到全蝎的特征多肽(IIAPPER),可用于区分全蝎与其他品种动物。2020年版药典采用液质联用法选取特征多肽的特征离子,对龟甲胶、阿胶进行定性鉴别;采用LC-MS MRM法对阿胶特征多肽进行定量分析[1]。刘睿等[15]采用生物质谱法结合蛋白质组学分析寻找鹿皮明胶中的物种特异性肽,并使用靶向质谱法验证特征肽。

本课题组前期对蜈蚣蛋白质进行分析[16]，从蜈蚣胃蛋白酶解液中鉴定出7个多肽,选取少棘巨蜈蚣中含量较高的3个特征肽段(LEEDLERSEERL、EEKDKALQNAEGEVAAL、MILPTGASSF),合成对照品。本文采用超高效液相色谱-质谱联用(UFLC-MS/MS)法,优化活性多肽的质荷比(母离子、子离子)和各个多肽成分的质谱条件,以多反应监测模式(MRM),建立蜈蚣中3个特征肽段的检测方法,比较少棘巨蜈蚣与不同品种蜈蚣的含量差异,以期为蜈蚣的真伪鉴别和质量评价提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

液质联用系统:LC-30AD型超高效液相色谱仪(日本岛津公司),AB Sciex 4500三重四极杆质谱仪(美国Sciex公司)。SOP型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司),KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),TGL 16G离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试剂

乙腈(质谱纯,德国Merk公司),甲酸(质谱纯,德国Merk公司),无水乙醇(分析纯,南京化学试剂股份有限公司)，Sep-Pak C18脱盐小柱(50 mg,美国Waters公司),胃蛋白酶(474 U·mg-1,南京翼飞雪生物科技有限公司,批号：YP0022-10),十二烷基硫酸钠(SDS,南京生兴生物技术有限公司,批号：2G232G23),二硫苏糖(DTT,上海凛恩科技发展有限公司,批号：RH162644),人工胃液(北京雷根生物技术有限公司,批号：1201A21)。

采集蜈蚣20批,其中少棘巨蜈蚣8批,多棘蜈蚣5批,黑头蜈蚣3批,墨江蜈蚣2批,哈氏蜈蚣2批;非蜈蚣品种8批,其中地龙3批,僵蚕2批,水蛭、土鳖虫、全蝎各1批，均由南京中医药大学陈建伟教授鉴定为正品。样品信息详见表1。

表1 20批蜈蚣及8批其他动物药来源信息表

多肽TD1(LEEDLERSEERL)、TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)、TD3(MILPTGASSF)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,信息详情见表2。

表2 3种多肽的信息表

2 方法

2.1 色谱条件

采用XSelect HSS T3(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B,按表3进行梯度洗脱,流速为0.6 mL·min-1;进样量为5 μL;柱温为40 ℃。

表3 梯度洗脱表

2.2 质谱条件

采用三重四极杆质谱检测器,电喷雾离子化(ESI),离子源喷雾电压(Ionspray voltage):5 500 V;离子源温度(TEM):550 ℃;气帘气压力(CUR):35 psi;雾化器压力(GAS 1):55 psi;辅助加热器压力(GAS 2):55 psi。正离子模式下多反应监测(MRM),监测离子对和优化的质谱参数见表4。

表4 3种肽段优化的质谱参数

2.3 对照品溶液的制备

取3种肽段对照品约10 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,加水溶解并稀释到刻度,摇匀,制备成单一对照品储备液，置于4 ℃冰箱内保存,备用。精密量取各对照品储备液适量,制备成2 μg·mL-1混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液制备

取样品粉末100 mg,精密称定,置于离心管中,加蛋白裂解液(2%SDS,20 mmol·L-1DTT,50 mmol·L-1PBS,pH 7.8)5 mL,超声处理(40 kHz,250 W)60 min,4 500 r·min-1离心10 min,取上清液,在冰浴上缓慢加入冷乙醇至80%乙醇浓度,边加边振摇,12 000 r·min-1离心10 min,取沉淀挥干,得到醇沉沉淀粉末,加人工胃液800 μL,密闭,振摇,于37 ℃恒温孵育30 min。加胃蛋白酶溶液200 μL制成活力值为14 200 U·mL-1的溶液1 mL,酶解8 h,后置85 ℃恒温水浴中灭活15 min,冷却至室温,以12 000 r·min-1离心10 min,取上清液,即得。

所得的蛋白酶解液经C18小柱脱盐处理后,注入液质联用仪分析。

3 结果

3.1 蜈蚣肽段的筛选

对鉴定得到的7个肽段进行合成,通过MRM模式初步比较7个肽段与少棘巨蜈蚣酶解液,确定3个响应值较高的肽段,即TD1(LEEDLERSEERL)、TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)、TD3(MILPTGASSF),3种肽段的二级质谱图见图1。其中TD1和TD2对应蛋白的登记号为“tr|A5D6I1|A5D6I1_9MYRI”,蛋白功能为原肌球蛋白(Tropomyosin);TD3对应蛋白登记号为“tr|L7R1H2|L7R1H2_9NEOP”,蛋白功能为Phosphopyruvate hydratase。

3.2 质谱分析

经质谱分析,选择TD1(LEEDLERSEERL)的母/子离子对为m/z506.59(三电荷)→638.4(双电荷),TD2(EEKDKALQNAEGEVAAL)的母/子离子对为m/z605.64(三电荷)→562.0(三电荷),TD3(MILPTGASSF)的母/子离子对为m/z1 023.5→666.1。

在优化的色谱和质谱条件下,对3种多肽TD1、TD2、TD3进样分析,其提取离子色谱图见图2。由图2可见,3种多肽分离度好,峰形对称,保留时间分别为3.43、4.24、5.55 min。

3.3 蜈蚣蛋白提取条件的考察

以提取方式(A),提取溶剂(B),沉淀方式(C)为3个因素,选取3个水平,按照正交试验表5进行实验。蜈蚣蛋白提取条件的正交试验结果见表6。

表5 正交试验因素水平表

表6 蜈蚣蛋白提取条件的正交试验结果

从表6结果和极差分析可知,各因素对3种肽段的综合影响力度为B>C>A,即提取溶剂影响最大,沉淀方式次之,提取方式无明显影响。考虑实际操作的简便性,最终确定蛋白的提取条件:蛋白裂解液作为提取溶剂,超声处理(40 kHz,250 W)60 min,沉淀方式为80%乙醇沉淀蛋白。

3.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液,逐级稀释,加水定容,制备成8个不同浓度的混合对照品溶液,分别精密吸取上述溶液各5 μL,注入液质联用仪,以对照品峰面积为纵坐标(Y),对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),制备3种多肽的标准曲线,建立回归方程,线性关系考察结果见表7。以信噪比S/N=10时的进样浓度为最低定量限(LOQ)。

表7 蜈蚣中3个肽段的线性关系考察结果

3.5 样品测定以及定性鉴别

取20批不同品种蜈蚣饮片及8批地龙、僵蚕、水蛭、土鳖虫和全蝎饮片,按“2.4”方法制备样品溶液,“2.1”色谱条件和“2.2”质谱条件进行测定,从标准曲线读出供试品溶液中相应于3种肽段的含量,结果见表8。少棘巨蜈蚣与其他动物药3种肽段提取离子色谱图见图3。少棘巨蜈蚣与其他4种非药典蜈蚣品种3种肽段提取离子色谱图见图4。

由图3A可见,在TD1对照品保留时间处,少棘巨蜈蚣均检出明显色谱峰,地龙、僵蚕、水蛭中均未检出色谱峰,而在全蝎和土鳖虫中有对应色谱峰,因此TD1可用于区别少棘巨蜈蚣与地龙、僵蚕和水蛭。由图3B～C可见,在TD2、TD3对照品保留时间处,少棘巨蜈蚣均检出明显色谱峰,在全蝎、土鳖虫、地龙、僵蚕和水蛭中均无对应色谱峰,因此TD2和TD3可区分少棘巨蜈蚣与全蝎、土鳖虫、地龙、僵蚕和水蛭。

由图4A～B可见,在TD1、TD2对照品保留时间处,少棘巨蜈蚣、黑头蜈蚣和多棘蜈蚣有明显色谱峰;表8也可以看出TD1、TD2在少棘巨蜈蚣、黑头蜈蚣和多棘蜈蚣中远高于哈氏蜈蚣,而墨江蜈蚣中未检出TD1和TD2。TD1和TD2可用于区别少棘巨蜈蚣与墨江蜈蚣、哈氏蜈蚣。由图4C可见,在TD3对照品保留时间处,少棘巨蜈蚣有明显色谱峰,黑头蜈蚣和多棘蜈蚣中未检出色谱峰,因此TD3可以区分少棘巨蜈蚣与多棘蜈蚣、黑头蜈蚣。

表8 28批样品中3种肽段的含量

综上所述,TD1、TD2、TD3三个肽段可用于区分蜈蚣属动物与其他动物药,同时也可区分药典品种少棘巨蜈蚣与上述4种常见的非药典蜈蚣品种。

4 讨论

本实验对色谱条件进行优化,分别考察了乙腈-水,乙腈-0.1%甲酸溶液等洗脱体系,加入甲酸以后色谱峰响应值较高,峰形较好,故优选乙腈为流动相A,0.1%甲酸溶液为流动相B进行了梯度洗脱。

质谱条件的优化中采用MRM模式,多肽的母分子通常选用多电荷离子,使其质量数适于质谱检测(m/z100～1 200)。在选择二级特征子离子碎片时,应尽量选取质量数偏大的碎片离子,以避免与其他小分子物质在鉴定过程中的混淆,确保方法的准确性。同时选取质谱响应较高的碎片,来提高检测方法的灵敏度。

常见的蛋白提取方式有浸提法和超声法,由于煎煮易使蛋白质变性,最高提取温度为60 ℃。故选取4 ℃冷浸提取、60 ℃热浸提取、超声处理3种方式对蜈蚣蛋白进行提取考察。选取水、1%碳酸氢铵和蛋白裂解液作为提取溶剂考察指标。对所得蛋白溶液进行沉淀方法考察,选取有机溶剂沉淀法(80%乙醇、80%丙酮)和盐析法(80%硫酸铵)。

本研究采用蛋白裂解液提取蜈蚣蛋白,胃蛋白酶酶解成多肽,以TD1、TD2、TD3作为对照品,建立了UFLC-MS/MS法分析蜈蚣中3个多肽成分。该方法可用于区分少棘巨蜈蚣与地龙、僵蚕、水蛭、全蝎及土鳖虫,同时通过比较3种多肽的差异,可区分药典品种少棘巨蜈蚣和4种非药典品种,为蜈蚣的质量评价和基础研究提供参考。