动物药现代研究方法学进展与展望

刘睿,武文星,朱悦,郭盛,赵明,曹鹏,段金廒

(1.南京中医药大学/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室,江苏 南京 210023;2.动物类中药与功能肽国际合作联合实验室，江苏 南京 210023)

1 动物药现代研究背景

动物药是指源于动物全体、器官、组织、生理或病理产物、提取物或加工品的中药材,自古被称为“血肉有情之品”,多有“行走通窜之功”,是传统中药重要组成部分。动物药在历代本草均有记载,如《五十二病方》记载动物药57种,《神农本草经》记载动物药67种,唐代《新修本草》收载动物药128种,《本草纲目》记载动物药462种[1],动物药资源分布广、活性强、疗效高等特点,在临床上具有不可替代的作用与地位。

1.1 动物药的特点与重要性

动物药资源广泛,除了陆地动物外,海洋动物资源储量巨大,占地球生物总量80%[2],加之海洋生物生长环境与陆地不同,因此其体内所含物质的化学性质特殊,是药物的重要来源,如传统中药海龙、海马、牡蛎、昆布等,均来源于海洋生物。动物药化学物质种类丰富,含有蛋白质类、肽类、糖类、脂质类、酶类等主要功效物质,药用动物所含有的毒素类物质,如蛇毒、蝎毒、蜂毒等,表现出极强的镇痛、舒张血管等活性,是重要的先导化合物来源[3]。中医认为,动物脏器气味醇厚,为血肉有情之品,在调养、补益等方面效果明显,如鹿茸具壮肾阳,补精髓,强筋骨等功效[4];犀角、羚羊角对高热、惊厥作用显著[5-6];熊胆清热、平肝、利胆、明目等[7]。

1.2 动物药研究薄弱环节

动物药在中医临床、方剂组成、中药制药行业中不可或缺,可替代品种很少,疗效独特,地位非常重要。动物药成分复杂,多数动物药的功效物质基础尚不明确,动物药生物效应机制、质量标准与质量控制等水平仍较低。目前动物药研究主要存在的问题包括:①动物药资源保护与资源可持续利用的矛盾亟待解决,如羚羊角、穿山甲、熊胆等资源保护与中医临床必要性之间的矛盾;②动物药物质基础研究亟待开展;③客观反映动物药传统功效的现代生物效应评价与效应机制研究亟待开展;④动物药成分复杂,其体内过程仍不明确,动物药体内过程及PK/PD研究亟待开展;⑤动物药生产加工溯源及过程精准质控方法与评价体系亟待建立。

2 动物药现代研究方法学

尽管我国动物药研究起步晚,研究基础薄弱,但是近20年来,随着药物化学、分析化学、生物学、药理学、材料学、生态学等多学科的发展,技术手段与仪器设备的不断提升,医药工作者围绕动物药领域科学问题开展学科交叉、协同攻关,建立了一系列动物药现代研究方法学,并突破了一些关键技术,我国动物药研究取得了长足进步。本文梳理了近年来在中药学、药物化学、生命科学、化学生物学、材料学等研究领域形成的技术手段,已经或即将应用于动物药基础研究的方法体系,为后续动物药基础与应用研究,及动物药产业发展提供借鉴(图1)。

2.1 动物药物质基础研究

动物药的物质组成以蛋白质类、肽类、氨基酸类、糖类等初生代谢产物为主,此外还含有脂肪酸类、核苷类、宏微量元素等。动物药物质基础研究方法不同于植物类中药的次生代谢产物研究方法,需采用适用于动物药物质基础研究的方法手段。

2.1.1 动物药大分子类成分的分离、纯化与鉴定 植物类中药次生代谢产物结构简单,稳定性好,容易分离纯化;而动物药初生代谢产物的分离、纯化、鉴定采用的方法需适合于如蛋白质、多糖、多肽、氨基酸等的分离纯化。基于蛋白质类、肽类、多糖类等生物大分子物质的理化性质,通常采用多维色谱联用的手段,基于活性导向进行分离纯化,课题组前期研究采用凝胶柱层析(Sephadex G-25)、离子交换层析(DEAE Sepharose)与反相柱层析(C18)联用的方法,从水牛角提取物中分离纯化获得3个活性肽类成分[8];Cao等[9]采用凝胶柱层析(Sephadex G-50)、阳离子交换层析(CM Sepharose)及反相柱层析(C18)联用,从东亚钳蝎中分离、纯化获得活性多肽Martentoxin I、BmK AngM1等。Wang等[10]采用离子交换层析(DEAE Cellulose)方法从蛤蜊提取物中分离纯化制备3个均质多糖,其中1个均质多糖的化学结构为[→4Glc1→4Glc1→4Glc1→2Glc1→4Glc1→4Glc1→4Glc1]n。基于活性导向分离的多维色谱联用技术是动物药功效物质分离、纯化的经典方法,也是动物药物质基础研究的主要方法之一,但存在耗时费力、纯化制备量少等缺点。

经典分离纯化方法适用于动物药中高丰度功效物质研究,但不适用于低丰度成分的分析鉴定。对于动物药中低丰度、结构复杂的蛋白质肽类成分分析,可采用制备特异性材料,对目标成分进行亲和富集的策略[11-12]。基于此,课题组通过制备核壳型磁性纳米材料,在最外层包裹金(Au)纳米层,通过形成稳定的硫金键(Au-S)对含巯基(-SH)或二硫键(-S-S-)的蛋白质、肽类成分进行富集,最终通过nanoLC-MS/MS对富集的目标物质分析鉴定。课题组制备的Fe3O4@PDA@Au纳米材料,富集了水牛角提取液中含-SH肽类成分,且富集的含-SH肽类成分相较于水牛角提取液,抗炎、抗氧化活性显著提升[13]。课题组进一步制备了Fe3O4@PEI@Au纳米材料,对眼镜蛇蛇毒中含-S-S-的毒素类成分进行富集分析,共鉴定了96个蛇毒蛋白,与传统蛇毒蛋白分析鉴定方法相比,该方法显著提升了含-S-S-蛇毒的鉴定通量,大大缩短分析时间[14]。Lu等[15]采用多克隆抗体亲和层析方法,将蝎毒肽Makatoxin-3(MkTx-3)的多克隆抗体耦合至Sepharose 4B层析柱上,根据MkTx-3抗体的专属性,富集纯化MkTx-3毒素,并测定其氨基酸序列。

2.1.2 多组学技术应用于动物药物质基础研究

2.1.2.1 转录组(Transcriptomics) 转录组通常指特定生理条件下细胞内所有转录产物,包括蛋白质编码RNA到非编码RNA的所有RNA分子的集合。近年来,转录组技术手段被应用于动物药物质基础研究,方法主要包括:将活体药用动物、动物器官或分泌物采用适当方法提取mRNA后,以mRNA为模板逆转录合成cDNA,通过PCR扩增制备cDNA文库并进行RNA-seq测序,组装、翻译获得蛋白质或肽类功效物质的序列信息,表达或固相合成制备功效物质,进一步验证生物活性[16]。研究人员采用转录组方法,从芋螺毒腺中发现不同家族的芋螺毒素,甚至发现新型胰岛素类似物[17];从不同蛙皮分泌物中发现一系列抗菌肽[18-19];从蝎毒腺中发现大量Na+通道、K+通道毒素,酶,宿主防御肽等毒素类成分[20]。

2.1.2.2 蛋白质组(Proteomics)与多肽组(Peptidomics) 近年来,越来越多科研工作者将蛋白质组、多肽组技术应用于动物药物质基础研究,目前蛋白质肽类成分分析主要采用的是自下而上(Bottom-up)质谱鉴定方法,通过特异性蛋白酶(以胰蛋白酶为主)酶切,以高分辨质谱分析获得MS/MS图谱,将二级质谱数据与蛋白质数据库比对匹配,鉴定蛋白质类、肽类成分[21]。Zhang等[22]采用蛋白质组学技术比较分析不同发育时期的鹿茸尖部蛋白质组成,明确鹿茸物质基础的同时,也为鹿茸快速生长和骨化的分子调控机制的研究提供了有力的支持。Liu等[23]通过RP-HPLC对蛇毒蛋白组分分级,以SDS-PAGE进行分离,对每个蛋白条带采用切胶鉴定的方法获得蛇毒蛋白类物质信息。课题组采用定性/定量蛋白质组方法对犀角、羚羊角、水牛角、牦牛角等角类动物药蛋白质类成分进行比较与归类,为珍稀濒危动物药替代资源寻找与评价提供方法与思路[24-25]。

动物药提取物或体内降解后释放多肽类成分,以及在分离、分析过程中,制备的多肽部位,均是一个复杂的多肽混合体系,依赖经典的多肽分离纯化技术手段,无法快速全面获知混合多肽部位中的物质组成,而基于高分辨nanoLC MS/MS的多肽组学技术,可实现动物药多肽类成分的快速定性分析[21]。课题组前期采用多肽组学方法对水牛角解热活性部位的多肽组成进行了分析鉴定,并对肽类成分的前体蛋白及释放规律进行整理,发现这些肽类主要由水牛角角蛋白的N-端、C-端序列释放而来;进一步采用仿生提取方法对羚羊角、山羊角进行处理,分析消化液中释放的肽类成分及组成规律,结果表明,羚羊角与山羊角释放的肽类成分来源蛋白、多肽序列与氨基酸组成均相似,这些肽段主要源于Ⅱ型角蛋白(KRT)、KRT14、KRT5、KRT34与KRT84的4个结构域[26]。

动物药通常直接粉碎或煎煮后入药,多数以口服为主,口服后其主要的蛋白质、肽类成分在胃肠液、肠道微生物等的共同作用下,发生特异性或非特异性降解,一些多肽、小肽或寡肽类成分释放出来,基于多肽组学研究这些肽类成分的组成与释放规律,对动物药功效物质的阐明具有指导作用。

2.1.2.3 修饰组学(PTMomics) 蛋白质的翻译后修饰(Post-translational modifications,PTMs)是指对翻译后的蛋白质进行化学修饰,以改变蛋白质的理化性质,从而影响蛋白质在体内的生物活性,干预细胞信号通路等[27]。在中药动物药物质基础研究过程中,我们留意到一些动物药在生产加工、煎煮熬制、生物体内消化液作用等过程中,部分氨基酸位点发生了化学变化,因而我们在蛋白质组、多肽组应用于动物药研究的基础上,提出“动物药修饰组”的概念,即围绕动物药蛋白质、肽类成分在炮制加工、提取熬制及体内消化液作用等过程发生的化学修饰、修饰类别、修饰位点、修饰数量等开展定性与定量研究,并进一步关联动物药传统功效特点与修饰组的相关性与规律研究,对角类、胶类动物药蛋白质、肽类物质与功效相关性规律进行探讨,提出可行的研究思路与解决方法,以系统阐明其功效物质基础[21]。

课题组以鹿皮胶为例,比较了鹿皮熬制加工前后胶原蛋白类成分的羟基化修饰(Hydroxylation)、脱酰胺修饰(Deamidation)变化,发现熬制后的鹿皮胶较鹿皮的羟基化、脱酰胺修饰均显著增加。胶类动物药的加工熬制过程是胶原蛋白溶解的过程,羟基化、脱酰胺修饰的共同特点都是形成-OH基团,如Asn脱酰胺后形成Asp,-NH2转变为-OH,而Pro发生羟基化后变为Hyp,即在Pro的五元环3-或4-位上引入-OH,-OH的形成一定程度上增加了胶原蛋白、肽类与水形成氢键的趋势,有利于胶原蛋白、胶原肽的溶出[28]。

研究还发现鹿皮胶中除了Pro羟基化修饰外,Lys也发生羟基化修饰,经羟基化修饰后,Lys转变为羟赖氨酸(Hyl)。在此基础上,一些特定位点的Hyl会进一步发生糖基化(Glycosylation)修饰:半乳糖(Galactose, Gal)通过β糖苷键与Hyl的O连接形成半乳糖基化修饰(Galactosyl-Hyl),葡萄糖(Glucose,Glc)通过α1-2糖苷键与Gal连接完成二糖基化(Glucosyl-galactosyl-Hyl)。修饰组分析表明,鹿皮胶中Gal-Hyl单糖基化修饰的肽段占6.30%,含Glc-Gal-Hyl二糖基化修饰的肽段占6.32%[29-30]。

2.1.2.4 多组学整合关联 杨彬等[16]提出基于“转录组学-蛋白质组学-多肽组学”整合关联研究动物药蛋白质、多肽类成分的思路,首先基于转录组学构建动物药蛋白质、肽类数据库,而后通过高分辨质谱分析,蛋白质数据库匹配鉴定,获得动物药的蛋白质、多肽类成分信息,进而采用分离纯化、化学合成等手段获得动物药蛋白质类成分,关联、验证动物药蛋白质、肽类成分的活性,从而系统阐释动物药蛋白质、肽类功效物质基础本质。

课题组前期通过系统鉴定表征动物药蛋白质、肽类物质组成,明确蛋白质、肽类成分发生修饰的位点与数量,将肽段序列规律性、修饰位点与数量的规律性整合,提出基于“蛋白质/肽组学-修饰组学”研究动物药功效物质基础的思路与方法[21],将动物药蛋白质类、肽类物质的氨基酸序列、修饰位点、修饰数量的规律性与传统功效关联,以阐释动物药功效物质基础与功效作用特点的科学内涵,为解决中药动物药物质基础、生物效应及质量控制等关键问题提出思路与方法。

2.1.3 生物信息学(Bioinformatics)与计算机辅助技术

2.1.3.1 基于生物信息学的数据挖掘与整理 生物信息学是生命科学、计算机科学、数学、化学等学科交叉结合的新兴学科,对生命科学的研究具有重要意义。通过在生物学中引入数学模型,将生物学理论研究应用于指导、设计和验证实验生物学,可显著缩短实验周期[31]。当今时代信息爆炸,基于大数据构建及完善动物药数据库,对于信息挖掘、数据发现、信息整合等意义重大,如构建全基因库、cDNA库、蛋白质、肽数据库、质谱MS/MS信息库等,并不断完善,从而保证动物药物质基础研究的高通量、系统性与准确性。高通量多组学研究形成了大量数据信息,特别是转录组学的巨大信息,需要借助生物信息学分析,充分挖掘数据信息。例如,基于转录组构建芋螺毒素数据库,平均而言,每个芋螺物种在基因序列水平上观察到>100个芋螺毒素序列,在肽水平上观察发现>1 000个芋螺毒素,这些需要借助生物信息学的方法对序列进行整理、归类,通过生物信息学识别芋螺毒素及其超家族分类[32]。

2.1.3.2 基于计算机辅助虚拟筛选的动物药活性物质发现 虚拟筛选技术是一个计算机辅助药物设计和高通量筛选的重要方法,是在已知药物靶点生物结构基础上发现新的配体的过程,从而极大程度缩小人工方法进行药物筛选的研究范围。虚拟筛选过程通常如下:选择配体(目标数据库或待筛选的化合物),选择靶点(受体、离子通道、酶等),在分子对接软件(Autodock、Discover Studio等)中进行虚拟筛选,通过分析配体与靶点对接得分大小及结合效率检测出最佳配体复合物的稳定性,再针对稳定性进行分子动力学模拟或体外实验的药物理论检测,从而筛选有效化合物[33-34]。

课题组前期通过膜分离、分级沉淀等方法制备不同蛤蜊酶解液部位,以血管紧张素转化酶(ACE)、二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制活性筛选确定活性部位,以LC-MS/MS鉴定活性部位全部多肽信息,将活性多肽与靶蛋白(ACE或DPP-4)进行分子对接(Molecular docking),筛选确定活性肽类成分,通过化学合成多肽序列,验证并获得ACE抑制肽(IC50=4.07 μmol·L-1)与DPP-4抑制肽(IC50=168.72 μmol·L-1),这一策略可显著提高动物药活性物质基础研究的效率[35-36]。李佳芸等[37]采用网络药理学及分子对接方法筛选马氏珍珠贝软体来源的具有潜在降糖活性的肽类成分,首先基于蛋白组分析鉴定马氏珍珠贝软体中的主要蛋白质类成分,通过Peptide Cutter在线工具模拟酶切获得马氏珍珠贝软体可能的肽类成分,进一步借助SYBYL-X 2.0软件，Swiss Target、GeneCards、OMIM-GENE-MAP等数据库信息进行靶点筛选与分子对接,从模拟酶切肽段中筛选获得28条潜在DPP-4抑制活性肽段及其对应377个基因靶点,进一步通过体外实验验证，确定其中最优的DPP-4抑制活性肽。

随着现代高效色谱分离、膜分离等技术的不断发展,越来越多的研究模式转向至“快速分离—高效鉴别—虚拟筛选”的研究思路,即通过制备型色谱分离手段(柱层析、分级沉淀、膜分离等)获得动物药活性部位,采用基于液质联用的化学物质组分析鉴定,确定化学组成信息,通过计算机模拟动物药活性部位中化学物质组成与靶蛋白相互作用情况,以此筛选确定活性化学物质,通过表达、化学合成等手段制备活性物质进行活性验证,最终阐明动物药功效物质[38]。

2.1.3.3 生物信息学与计算机结合的蛋白质、肽类结构预测 一直以来,科研工作者需要借助X射线、冷冻电镜等实验确定完整的蛋白质结构。而现阶段可通过生物信息学结合计算机辅助解析(机器学习、人工智能等)来预测蛋白质、肽类的结构。传统的蛋白质、肽类结构预测方法主要包括基于模板方法(Template-based method,TBM)和无模板方法(Template-free method,TFM)。TBM包括:数据检索得到目标蛋白的一组同源性序列,并根据序列获得一个或多个折叠结构模板,目标序列与模板序列一致的片段则直接使用模板的对应折叠结构;对于目标序列与模板序列不一致的区域,采用碎片组装、优化算法或是数据库方法等单独预测。TFM通过从蛋白质数据库中根据同源性序列比对结果找到一些片段的结构并将其放入片段库中,然后找到评分较高的片段结构拼成初始结构,采用片段组装的方法,以片段结构为单元,通过计算机辅助等方式演化蛋白质全局结构[39]。

二硫键是由蛋白质2个半胱氨酸之间配对形成的一种共价键,可存在于同一条蛋白质多肽链内,亦可存在于不同多肽链之间。利用生物信息学结合计算机科学、数学、生物学等技术方法进行二硫键预测:基于现有蛋白质空间结构数据库,如PDB,构建高精度蛋白质二硫键数据集,在此基础上对该数据集进行详细的统计与计算分析,研究二硫键的形成与分布规律,预测目标蛋白、多肽的空间结构。二硫键的形成是蛋白质、肽类折叠过程的重要步骤,二硫键的准确预测对于活性肽类发现、蛋白质工程、药物设计等都有着积极而重要的意义[40]。

2.1.4 分子生物学与生物工程 人工麝香的研制与产业化是动物药研究领域标志性成果之一,通过对麝香主要成分,麝香酮、芳活素、激素类等成分的合成与配制,从化学成分类同性、生物活性一致性、理化性质近似性、低毒性等方面研制成功人工麝香。人工麝香的研制是我国珍稀动物药材代用品研究的重大突破,为珍稀动物药类效资源、替代产品的研究开辟新途径[41]。

基于生物工程技术制备动物药来源活性蛋白质、肽类物质,是除化学合成外另一种主要的产业化途径,例如,1991年中国科学院生物物理研究所构建了酵母工程菌,分泌表达的水蛭素抗凝血酶活力单位10～20 ATU·mL-1,1997年谭树华等构建了重组水蛭素工程菌,而后进一步优化发酵工艺,获得发酵液的抗凝活力可达850 ATU·mL-1[42]。庾石山等采用重组表达的方式制备了一系列角蛋白,重组角蛋白具有解热、镇痛、抗惊厥等功效[43]。杨金玲、夏扬等[44-45]采用基因克隆与重组表达的方式制备蝎毒多肽BmK AngM1与Bmk NaTx12。此外,芋螺毒素[46]、蜘蛛多肽[47]、蜈蚣多肽[48]等亦可通过重组表达的方式制备。

近年来,类器官(Organoids)培养技术日益发展,应用于生命科学、医学等领域,类器官来源于自组织和自我更新的干细胞,是利用干细胞的自组织特性进行体外3D培养后形成的细胞团[49]。在研究来源器官发育、生物学和病理生理学方面,类器官比传统细胞培养更符合生理机制与进程,现阶段已有多种策略可在体外培养得到具有功能的胰岛类器官,并探讨胰岛类器官实际应用于糖尿病的研究与治疗的可能性[50]。在动物药研究方面,Jens等[51]建立了蛇毒腺类器官,并应用于体外生成蛇毒毒液。此外,有研究开发了一种皮肤重建的方法,基于人源性角质提取物与纳米纤维结合,采用3D打印技术制备一种新型皮肤替代物[52],亦有报道将角蛋白通过3D打印方式制备成犀角[53]。这些研究启示我们,化学、生命科学、医学的多学科交叉给动物药物质基础研究提供了新的思路与途径,可能成为获取动物药功效物质、寻找珍稀濒危动物资源类效品或替代资源更高效的方法与手段。

2.2 动物药传统功效与生物学评价研究

2.2.1 动物药功效与机制研究 活性强是动物药特点之一,如蜈蚣、全蝎具有息风镇痉,通络止痛,攻毒散结之功;水蛭具破血通经,逐瘀消癥之功;土鳖虫具破血逐瘀,续筋接骨之功;斑蝥具破血逐瘀,散结消癥,攻毒蚀疮之功等。动物药的生物效应机制有必要阐明,为动物药功效发挥与中医临床应用提供理论依据。Lu等[15]研究发现蝎毒的活性物质主要是作用于Na+、K+、Cl-、Ca2+离子通道的毒素多肽,其中短链毒素由29～39个氨基酸残基组成,含有3对或4对二硫键,主要作用于K+通道或者Cl-通道,分离纯化得到的东亚钳蝎粗毒可以通过直接增强Nav1.7的活性产生致痛作用。水蛭素具有很强的抗凝血酶活性,是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽,水蛭素N-端有3对分子内二硫键,分别为Cys6-Cys14、Cys16-Cys28与Cys22-Cys39,二硫键的结构决定了水蛭素稳定的空间结构和凝血活性[54]。研究表明,水蛭素活性中心位于结构紧密的N-端,能够识别凝血酶碱性氨基酸富集位点,并与之结合[55]。水蛭素C-端含有多个酸性氨基酸,有利于其和凝血酶结合。水蛭素C-端含有一个被磺酸化的酪氨酸(Tyr63)以及一个被糖基化的酪氨酸(Tyr45)。酸性氨基酸残基能阻止凝血酶与纤维蛋白原结合,从而产生抗凝血的作用[56]。水蛭素N-端1～3位的氨基酸可与凝血酶活性位点结合,是其重要的结构序列;水蛭素还含有Pro-Lys47-Pro的结构单元,在保持分子结构稳定性的同时,可引导水蛭素以正确的空间方向与凝血酶结合。而水蛭素C-端所含有的Asp56-Phe-Xaa-Yaa-Ile-Pro结构单元可阻断凝血酶上的纤维蛋白原识别位点。目前已发现的水蛭素类结构均含有上述特征性结构域或结构单元,这是水蛭素抗凝血酶活性的关键。蟾毒内酯为源于动物药蟾酥的一类小分子化合物,其中沙蟾毒素(Arenobufagin)的抗肿瘤活性最强,可能与活化PI3K/Akt/mTOR信号通路参与凋亡和自噬调控的抗癌机制有关[57];华蟾毒精(Cinobufagin)通过靶向微管切割蛋白KATNB1抑制微管聚合从而抑制肿瘤细胞有丝分裂[58]。

动物药成分复杂,起效方式与作用特点均不同于传统植物药,近年来基于化学生物学发展形成的药物生物效应机制研究方法,也为动物药效应机制研究提供借鉴与方法,如运用多组学技术从分子水平阐述药物干预前后的基因、蛋白质、神经肽、内源代谢物等变化,寻找作用通路与靶点并验证。此外,基于天然产物靶点识别策略:通过共价结合亲和磁珠[59-60]、生物素修饰[61]、生物正交反应[62]、光亲和探针[63]等筛选靶点;基于非标记定量的天然产物靶点识别方法:药物亲和反应的靶点稳定性技术(Drug affinity responsive target stability,DARTS)[64]、细胞热转移实验(Cellular thermal shift assay,CETSA)[65]、靶点响应可及性变化谱技术(Target responsive accessibility profiling,TRAP)[66]、色谱共洗脱靶点识别技术(Target identification by chromatographic co-elution,TICC)[67]等新的技术与策略,均可借鉴作为动物药活性物质作用机制研究的技术与方法。

2.2.2 适宜于动物药研究的模式生物建立与评价研究 动物药传统服用方法以口服为主,富含蛋白质、肽类的动物药或提取物经过体内复杂消化过程后,发挥生物效应的物质可能并非蛋白质、肽类原型,因此仅通过细胞模型或离体器官模型,不能很好地反映动物药体内效应过程,需要开发基于模式生物评价的整体动物模型,以评价动物药生物效应。

2.2.2.1 斑马鱼模型建立与应用 细胞模型或啮齿类动物模型是中药活性成分和毒性筛选的传统方法,但存在不能反映机体完整情况或开销大且费时费力的缺点。斑马鱼作为一种模式生物,胚胎和幼鱼体积小,可大规模饲养于细胞板,不仅减少实验动物开支,且斑马鱼胚胎及幼鱼身体透明，能直接吸收培养介质中物质,因此适用于复杂中药活性成分的大规模筛选以及毒性评价。更重要的是,斑马鱼是一种完整动物模型,疼痛、肿瘤转移、血管张力和肠道运动等可在斑马鱼模型中观察到的疾病相关表型,同时可以保留中药代谢过程,能够对有效成分及其代谢组分同时进行测评,在中药代谢研究中可以得到更为完整的研究结果[68]。张友刚等采用斑马鱼模型,从动物免疫相关细胞因子、巨噬细胞吞噬能力等指标评价新阿胶对化疗诱导免疫损伤的保护作用[69]。

2.2.2.2 秀丽隐杆线虫模型建立与应用 秀丽隐杆线虫作为模式生物评价疾病发生与调控机制有诸多优势,秀丽隐杆线虫基因组保守性高,且和人类疾病的相关性高。秀丽隐杆线虫体积小,生命周期短,易于在实验室条件下培养。此外,秀丽隐杆线虫整个生命周期都是透明的,可通过荧光标记来跟踪虫体内物质变化[70]。安苗青等以秀丽隐杆线虫模型评价龟鹿二仙胶的抗衰老活性,结果表明,龟鹿二仙胶可显著提高线虫行动能力,改善氧化损伤状态,延长线虫平均寿命[71]。刘春红等以秀丽隐杆线虫为模式生物,通过寿命、紫外应激、热应激、运动、产卵等实验检测鹿茸乙醇提取物对线虫衰老的影响[72]。李振旺研究马鹿角水提物可能通过激活线粒体信号通路,上调相关抗氧化基因表达水平,增强线虫抗氧化应激能力,延缓线虫衰老[73]。

2.2.2.3 果蝇模型建立与应用 果蝇作为模式动物,有着易于饲养、繁殖力强、生长周期短、遗传背景明确等特点。正因如此,以果蝇为模式动物的研究吸引了越来越多的科研工作者,而研究过程中,许多生命现象和规律也正在揭示或即将揭示。基于果蝇模式动物研究,胚胎发育、先天性免疫和昼夜节律等成果均先后获得了诺贝尔生理医学奖,有效推动了生命医学发展[74]。史晋源等以果蝇为模式动物研究甲鱼肽对果蝇寿命的影响,结果表明,甲鱼肽可以提高雌、雄果蝇体内抗氧化酶活力,缓解脂质过氧化作用,从而延长果蝇寿命,具有潜在抗衰老作用[75]。

2.3 动物药品质评价与质量控制研究

随着科技进步,仪器方法日益完善,动物药质量控制研究方面取得了长足进步,专属性好、准确性高、灵敏度高的方法,广泛应用于动物药饮片、中间体、成药的质控,对动物药质量标准及质量评价技术手段不断提升具有重要作用。

2.3.1 DNA条形码的应用 作为一种新兴的生物鉴定方法,DNA条形码技术是应用基因组中一段标准的DNA短序列进行物种鉴定的分子诊断技术[76]。Hebert[77]提出COⅠ序列可作为DNA条形码序列对动物进行鉴定。Yao等[78]提出ITS2可作为COⅠ序列的补充序列对动物进行鉴定。陈士林等[79]在大量样本研究的基础上,建立了以COⅠ为主体、ITS2序列为补充的动物药材DNA条形码鉴定体系,该体系已纳入《中国药典》。此外,由于一些动物物种的COⅠ序列差异较低,甚至不变,Luo等[80]提出用12S rRNA基因的种内和种间遗传变异来鉴别角类动物药,可准确区分绵羊角、山羊角、水牛角、马鹿角、羚羊角。

2.3.2 特征肽的发现与动物药品质评价 作为DNA条形码鉴别的重要补充方法,特征肽作为动物药专属性检测指标,越来越广泛地应用于动物药质量控制,2020年版《中国药典》中的阿胶、鹿角胶、龟甲胶均以特征肽进行鉴别。特征肽应具有专属性与易检测性,即仅在目标样品中可被检测出来,且响应性好。特征肽的发现与应用对动物药质量控制与标准提升意义重大。

2.3.2.1 基于化学物质组与多元统计分析的特征肽发现与应用 程显隆等[81]通过UPLC-QTOF-MS对动物药酶解物总离子流进行分析,将所有质谱离子信息采用多元数学统计主成分分析(PCA),结合正交偏最小二乘法(PLS-DA)比较,筛选离散值即为潜在的特征肽,进一步依据质谱碎片信息鉴定了部分特征肽的信息,最终可鉴别阿胶、牛皮胶、猪皮胶、龟甲胶与鹿角胶。在此方法下，结合多元统计分析方法,从大量数据中提取出关键离子信息以发现特征肽,因此对样本量要求较高,即样本量越大特征肽的准确度越高。

2.3.2.2 基于生物信息学比较分析的特征肽发现与应用 Li等[82]通过Shotgun分析动物药样品中主要蛋白类型,基于蛋白质数据库获取各物种相应类型蛋白质序列信息,通过比对不同物种同源蛋白序列中的差异氨基酸位点,并以含差异位点的胰蛋白酶酶切肽段为潜在的目标特征肽,通过LC-MS/MS对验证这些潜在特征肽,最终筛选确定特征肽,可用于阿胶、马皮胶、牛皮胶、猪皮胶的鉴别与区分。生物信息学分析比较是基于已知的物种蛋白质序列发现特征肽的方法,可行性与准确度较高,但可能因缺乏特征肽的PTM信息,而缺失部分潜在特征肽。

2.3.2.3 基于多肽组与数学集合比较分析的特征肽发现与应用 课题组提出采用多肽组与数学集合结合的分析方法寻找特征肽:基于非靶向质谱方法分析待测动物药样品、伪品的全部多肽序列信息,取不同批次待测动物药样品肽段序列信息的交集设为集合Ⅰ(即这部分肽段在每个批次待测样品中均可被测出),取其他各伪品样品中肽段序列信息的并集为集合Ⅱ(即只要存在的伪品肽段均包含在内)。集合Ⅰ相对于集合Ⅱ的补集,即仅在集合Ⅰ中存在,且不在集合Ⅱ中存在的肽段信息即为潜在的特征肽,进一步通过靶向质谱验证确定特征肽。通过这一方法发现了6条鹿皮胶特征肽序列,及其他物种的8条同源肽段,基于这些特征肽可鉴别区分鹿皮胶、阿胶、马皮胶、牛皮胶与猪皮胶[83-84]。根据相同方法,发现了4条水牛角特征肽,可用于区分水牛角、山羊角与猪蹄甲[85]。

2.3.2.4 基于定量多肽组分析的特征肽发现与应用 不同物种来源的样品,由于种属差异导致个别氨基酸位点的差异是发现种属间特征肽的关键。然而,对于相同物种不同药用部位,如鹿角胶与鹿皮胶,其蛋白质序列一致,不存在差异氨基酸位点。为解决相同来源不同部位动物药区分问题,课题组采用非标记定量(LFQ)多肽组学结合糖基化位点分析方法,筛选含量差异特征肽,结合PCA、火山图(Volcano plot)和热图(Heatmap)对比寻找具有潜在差异的糖基化肽段,通过质谱的MRM模式筛选并确证了4条含有糖基化修饰位点的特征肽,在鹿角中含量显著大于鹿皮,从而实现鹿角与鹿皮的区分[86]。此外,课题组采用定量多肽组与数学集合分析结合,发现3个特征肽,可实现近缘物种水牛角、牦牛角及黄牛角的鉴别与区分[87]。

2.3.3 专属性成分的发现与应用

2.3.3.1 用于掺伪鉴定与评价研究 基于特征肽的“有”或“无”可实现动物药的种属鉴别,如鹿胶样品中仅检测出鹿源特征肽的为正品,如检测出其他物种特征肽则表明存在掺伪情况。而掺伪样品中伪品物种特征肽相对含量与伪品掺入量呈线性相关,可用于计算掺伪比例。对于响应灵敏度高的特征肽,可实现1%的掺伪检测限。据此,课题组实现了掺有牛皮的鹿皮胶、掺有牛皮的阿胶、掺有马皮的阿胶等样品掺伪比例的检测,并根据不同物种特征肽的相对峰面积确定掺伪比例;此外,根据鹿皮、鹿角特征肽含量的相对差异,可计算鹿角胶中掺有鹿皮样品比例范围[29,84,86]。

2.3.3.2 特征肽的绝对定量研究 2020年版《中国药典》阿胶的含量测定项下以UPLC-MS/MS对2条驴源多肽进行绝对定量测定,从而规定阿胶含量限度。课题组前期研究中发现,待检测酶解样品中存在大量胶原肽,在质谱离子化过程中,由于胶原肽中大量甘氨酸残基的促质子化作用,使得部分特征肽在ESI离子化过程中,质谱响应显著增强,这一响应增强(Response boosting)效应可显著提高特征肽的检测灵敏度,部分特征肽检测LOD可达0.5 ng·mL-1,这对于动物药真伪鉴别具有积极意义。同时,通过同位素特征肽的校正,建立了驴、猪、牛特征肽的绝对定量方法学,可准确检测动物药中特征肽的绝对含量,阿胶、牛皮胶及猪皮胶中特征肽的含量分别为(1 763±146)、(1 805±245)、(145±37)μg·g-1[88]。

3 动物药现代研究展望

3.1 构建动物药大数据库

基于全基因组测序技术、蛋白质组多肽组技术、5G云数据技术等,对动物类中药的基源动物、动物药材、饮片、加工中间体、中成药等的生产工艺、物质基础研究、质量评价等进行全面分析与数据共享。

目前动物药,尤其是濒危珍稀动物药的全基因数据、蛋白质数据不完善,严重制约着动物药物质基础、质量评价研究。如课题组前期开展珍稀濒危角类动物药物质基础研究中,因犀牛、赛加羚羊基因库与蛋白质库的不完善,只能采用近缘物种(牛科,Bovine)的蛋白质数据库进行匹配鉴定,大量的MS/MS图谱与牛科蛋白数据库不能匹配,而无法获得关键物质基础信息,更无法获得犀角或羚羊角专属性物质基础。根据现有基因信息加以注释分析,获取基因功能信息及蛋白质信息,如已有报道关于赛加羚羊的全基因组测序,但是未完成注释工作,可在此基础上进一步完善基因注释,以帮助完善动物药物质基础研究。

3.2 动物药功效物质基础与体内过程研究

动物药常以粉末或煎煮口服使用,且作用确切。动物药物质组成主要包括:蛋白质类、肽类、脂类、氨基酸类、生物碱类、元素类等,基于现代分析化学、仪器分析的技术手段,这些物质基础基本阐明,而基于整体动物效应评价手段亦可明确动物药的生物效应。但是,连接动物药“物质”与“功效”之间的桥梁,即动物药体内过程,仍不清晰,不同于小分子化合物的体内Ⅰ相代谢与Ⅱ相代谢,动物药的体内过程像是一个“黑箱”,亟待建立适宜的方法体系加以阐明。现代研究提出了一些关于蛋白质类、肽类成分体内过程研究思路,并建立方法,如同位素标记与示踪、荧光标记成像、肽类成分跨膜转运、肠道微生物干预等,但是仍无法阐明动物药如何在机体的复杂环境中发挥生物效应的机制。因此,功效物质的揭示与体内过程的阐明是动物药研究亟待开展与解决的研究方向之一。

3.3 动物药溯源与精准质控体系

刘昌孝院士提出以中药质量标志物(Q-Marker)为核心,从质量要素的传递与溯源的基本研究模式,促进中药大品种及中药方剂质量标准提升[89]。动物药质量控制仍存在不足,需要完善与提升,建立动物药质量评价方法体系。同样的,动物药从养殖、采收加工、炮制、提取、纯化、制剂成型过程中,产业链长、行业跨度大、物质组成复杂,因而动物药的原料、中间体及产品的质量控制与溯源系统的构建是保证动物药行业健康发展的关键。基于中药Q-Marker思路,中药动物药可通过如DNA片段、专属蛋白质、特征肽段等标志物的发现与应用,对动物药原料、中间体、产品,乃至产业化过程进行溯源与精准质控。以胶类动物药为例,可在包括下述研究基础上构建溯源与精准质控体系:①通过DNA鉴定对原料进行基原鉴定;②基于物种专属性特征肽、胶原蛋白的检测实现中间体与胶类药材的质量控制;③基于专属性特征肽定性/定量分析实现以类动物药为原料方剂或产品的质量控制。

3.4 濒危珍稀动物药类效资源研究与替代产品开发

濒危珍稀动物药类效资源的寻找评价研究及替代产品开发是动物药发展方向之一。由于多种因素的影响,犀角、羚羊角等珍稀角类动物药资源的应用受到限制或明令禁止,珍稀角类药用动物种群锐减,亟需寻找类效资源以缓解资源可持续利用与资源保护的矛盾。目前水牛角及其浓缩粉已作为犀角代用资源,而山羊角在解热、抗惊厥功效方面被作为羚羊角类效资源使用,如现代中药“金振口服液”,具有清热解毒、祛痰止咳的功效,工业生产均以山羊角替代羚羊角制备金振口服液,解热与抗炎的功效与羚羊角制备的金振口服液相当。现阶段,人工麝香、人工牛黄、人工虎骨等动物药资源基本实现了人工替代与产业化[90],而羚羊角类效资源研究与替代产品开发亟待开展(图2)。

4 结语

本文基于生物化学、天然产物化学、中药资源化学、系统生物学、生物工程、生物信息学等多学科现代科学技术进展,结合动物药的品质形成、功效物质基础、药材生产与质量评价、多途径替代策略等层面,较为系统地回顾分析了近些年来我国动物药研究的方法学进展,从基于多组学、生物信息学、生物工程等技术方法的动物药功效物质纯化、鉴定与制备研究;动物药生物效应评价与机制研究;基于专属肽类定性/定量分析的动物药精准质控研究;动物药现代研究方法学的展望等方面进行了梳理和凝练[91],以期为推动药用动物资源和动物药研究和产业化提供方法学借鉴,为进一步丰富完善适宜于动物药研究的系统方法学提供参考,为促进我国动物药资源与特色经济产业可持续发展做出应有的贡献。