使用碱性蛋白酶去除犬骨骼标本软组织技术

万 玲 ， 吉尚雷 ， 李春华 ， 王 超 ， 高 锋 ， 王雨田 ， 崔晓雯 ， 田长永

(辽宁农业职业技术学院 ， 辽宁 营口 115009)

制作犬骨骼标本不仅可以锻炼学生的动手能力，开拓学生的创新思维，还可以将标本作为直观教具，帮助学生理解犬骨骼的构造与组成，强化学生对犬解剖知识的理解，巩固教学效果[1-3]。犬骨骼标本在实际教学过程中起到其他教具不可替代的作用，对兽医诊疗人员的临床工作也能起到较大的指导作用[4]。制作犬骨骼标本的步骤主要包括去除软组织、脱脂、漂白以及模仿动物的正常自然姿态进行串接。软组织的去除程度关乎于后续的脱脂时间、漂白效果及骨骼完整性，是制作优质犬骨骼标本的关键。有动物解剖学者使用浓度为0.3%～0.5%的蛋白酶去除仓鼠和家兔的肌肉组织来获取骨骼标本[5-7]； 还有临床解剖学者使用浓度为1.0%～1.5%的碱性蛋白酶去除人体骨骼标本软组织[8]。然而蛋白酶是否适合犬骨骼标本的制备尚未见报道，为此，笔者在参考以上文献的基础上尝试选用5种不同浓度的碱性蛋白酶对犬四肢骨、胸骨和肋骨、脊柱骨及头骨4组标本进行软组织去除试验，观察不同浓度碱性蛋白酶分解液在不同作用时间内，对不同部位骨骼的软组织的分解效果，以期建立一种优于传统方法的适合于制备犬骨骼标本的蛋白酶分解方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 碱性蛋白酶粉[食品级碱性蛋白酶(酶活性 200 000 U/g)]，购自夏盛实业集团有限公司；十二烷基苯磺酸钠(LAS)，购自天津致远化学试剂有限公司；30%过氧化氢(H2O2)；带盖有机玻璃容器；恒温培养箱。

1.2 试验动物 试验犬(体重4～6 kg，年龄3～5岁)5只，均来自辽宁农业职业技术学院小动物饲养场。

1.3 方法

1.3.1 骨骼样本预处理 将5只试验犬安乐死后进行剥皮，称量其剥皮后体重并记录，剃除附着在骨骼上的大块肌肉，每只犬均剃除约70%左右,分别称量剔除大块肌肉后骨骼样本的重量(骨骼重量)。

1.3.2 配制不同浓度的碱性蛋白酶分解液 将碱性蛋白酶(g)与蒸馏水(mL)分别按不同浓度(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%)配制碱性蛋白酶分解液(pH 6.8～8.5)；每份骨骼使用碱性蛋白酶分解液的体积/mL=骨骼重量/g×5[6]。

1.3.3 恒温培养 将1.3.2中配制好的5种不同浓度的碱性蛋白酶分解液放在5个有机玻璃容器(有盖)内，再将1.3.1中预处理过的5只犬的骨骼样本分别放入上述5个有机玻璃容器内(1只犬的骨骼样本放在1个浓度的碱性蛋白酶分解液中)，放入恒温培养箱调至约50 ℃(碱性蛋白酶水解的最适温度)[8]。

1.3.4 碱性蛋白酶分解液分解效果观察 分别于作用12、24、36 h和48 h查看不同浓度的碱性蛋白酶分解液对软组织的分解速度和对骨骼的影响，并根据前期消化程度，在作用54、60 h和66 h再次观察对不同部位骨骼的影响。

1.3.5 脱脂 将软组织分解完的犬骨骼放入0.02% LAS溶液中室温进行脱脂，随着时间变化观察骨骼颜色和溶液中的油脂量。

1.3.6 漂白 将脱脂后的犬骨骼放入配制好的4% H2O2中漂白，每隔1 h观察漂白效果，漂白后的骨骼用清水冲洗2次，晾干即可。

2 结果

2.1 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用不同时间的软组织分解效果 通过对预处理后的5只犬的头骨、四肢骨、胸骨和肋骨及脊柱骨分别在5种浓度的碱性蛋白酶分解液中进行分解观察，结果见表1～4，发现预处理过的5只犬的骨骼在除0.1%浓度外的其他4种浓度的碱性蛋白酶分解液中作用48 h后软组织残留量非常少，只有微量筋膜等结缔组织残留，软组织基本分解且骨质均完好；而在0.1%浓度的碱性蛋白酶分解液中除头骨作用60 h后有微量组织残留之外，其他部位骨骼作用60 h后的软组织没有完全分解。

表1 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用不同时间对头骨软组织的分解效果Table 1 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on skull soft tissues decomposition after different times

表2 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用不同时间对四肢骨软组织的分解效果Table 2 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on limbs soft tissues decomposition after different times

表3 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用不同时间对肋骨和胸骨软组织的分解效果Table 3 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on ribs and sternums soft tissues decomposition after different times

表4 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用不同时间对脊柱软组织的分解效果Table 4 Effect of different concentrations of alkaline protease solutions on spines soft tissues decomposition after different times

2.2 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用不同时间对骨骼的影响 于0.3%浓度的碱性蛋白酶分解液中，头骨在作用48 h后，四肢骨在作用66 h后，胸骨和肋骨在作用60 h后所有软组织完全分解(图1)。在作用66 h后所有骨骼的骨质没有明显破坏，长骨的骨骺完好，颅骨的骨缝没有明显的分离现象，肋骨没有断裂。

图1 0.3%碱性蛋白酶分解液去软组织效果Fig.1 Effects of soft tissues removal in 0.3% alkaline protease solutionA:头骨作用48 h； B:前肢骨作用66 h； C:肋骨作用60 hA: Skulls for 48 h; B: Front limb bones for 66 h; C: Ribs for 60 h

于0.5%浓度的碱性蛋白酶分解液中，脊柱在作用60 h后，胸骨、肋骨和头骨在作用48 h后，所有软组织完全分解；头骨在作用54 h后出现表面骨质破坏；四肢骨在作用36 h后出现了骨骺断裂现象，但还残存微量结缔组织，在作用60 h后残存的微量结缔组织完全分解、骨骺脱落(图2)。

图2 四肢骨骨骺脱落Fig.2 Epiphysis of limb bones fell off

于0.7%和0.9%浓度的碱性蛋白酶分解液中，脊柱在作用60 h后，胸骨、肋骨和头骨在作用48 h后，所有软组织完全分解；但头骨在作用54 h后，出现表面骨质破坏，在作用60 h后有骨裂现象(图3B)；而在0.3%浓度的碱性蛋白酶分解液中作用相同时间头骨完好(图3A)。

图3 不同浓度碱性蛋白酶分解液作用的头骨Fig.3 Skulls in different concentrations of alkaline protease solutionsA:0.3%浓度作用60 h； B:0.7%浓度作用60 h； 箭头：明显骨裂A:0.3% concentration for 60 h; B:0.7% concentration for 60 h; Arrow:Apparent fracture

于0.7%和0.9%浓度的碱性蛋白酶分解液中，四肢骨在作用36 h后出现了骨骺断裂现象，但还残存微量结缔组织，在作用48 h后耻骨联合处开裂(图4)，在作用60 h后残存的微量结缔组织才完全分解。

图4 耻骨联合处开裂Fig.4 Pubic symphysis was dehissed 箭头：残余微量结缔组织Arrow: A small amount of residual connective tissues

2.3 脱脂效果 利用除0.1%浓度以外的其他4种浓度的碱性蛋白酶分解液去除软组织48 h后的骨骼油脂量均很少，在0.02% LAS溶液中室温进行脱脂24 h后，溶液中油脂量较少。

2.4 漂白效果 经过0.3%浓度碱性蛋白酶分解液去软组织和0.02% LAS溶液脱脂后的骨骼，在4%H2O2中漂白4 h后，骨骼洁白(图1)。

3 讨论

3.1 犬个体的差异对蛋白酶作用的影响 犬的体重和骨质的坚硬程度决定了骨骼标本的质量[4]。幼龄犬骨质未发育完全，老龄犬则骨质疏松，利用蛋白酶处理幼龄和老龄犬的软组织都会对骨骼造成损伤，影响后续标本的质量。体重应选择均等且偏瘦的犬，偏胖的犬软组织较多，前期剃除附着的大块肌肉较困难。因此应选择3～5岁龄且体重均在4～6 kg的青壮年犬制作骨骼标本，此年龄段均等体型的犬骨质坚硬，较易剔除大块肌肉，剩下的软组织易被碱性蛋白酶分解液分解且误差小。

3.2 剃肉程度对碱性蛋白酶分解时间的影响 本试验发现，前期骨骼上的大块肌肉剔除程度可影响碱性蛋白酶的处理时间，剃除过少剩余过多会延长分解时间，增加做标本的时间周期；剃除肌肉过多，剩的软组织很少虽然分解时间短，但容易伤及骨骼，影响骨骼的完整性。本试验过程中通过摸索发现，剃除剥皮后犬体重的70%左右为宜。

3.3 碱性蛋白酶分解液去除软组织对后续脱脂和漂白的影响 本试验证明，利用碱性蛋白酶分解液去除软组织后的骨骼油脂量很少，大部分油脂在浸泡过程中溶解在碱性蛋白酶分解液中，大大加快了后续脱脂的过程。0.02%LAS溶液室温脱脂12 h[4]后，骨骼上基本无油脂，溶液中油脂量较少，并且骨骼的颜色较白。一般情况下，骨骼油脂量越大，骨骼颜色越黑。

3.4 使用碱性蛋白酶分解液去除软组织的优点 由于自来水的pH介于6.8～8.5，碱性蛋白酶在pH 6～10时比较稳定，为了节约成本，本试验使用的是夏盛食品级工业碱性蛋白酶(活性200 000 U/g)，根据试验结果估算，处理1副完整的犬骨骼大约需要15 g碱性蛋白酶，成本极其低廉。本方法设备简单，灵活选择，只要能提供酶消化所需温度的装置便可，如恒温培养箱、恒温水浴锅都可以实现。此外，本方法安全省力，可操作性强。使用碱性蛋白酶分解液处理骨骼上的软组织更加温和，对骨骼损伤较小，通过浸泡就能够实现软组织的去除，尤其是一些死角也可以消化干净[7]，碱性蛋白酶对人体的伤害非常小，可随时取出观察骨骼变化，减少因时间长未观察引起的对骨骼的损伤，并且不会污染环境，废液容易处理，可直接排入下水道。