一种新型次氯酸消毒剂的杀菌效力评价

张向阳 ， 张靖菊 ， 陈 晨 ， 刘春双 ， 王玉凤 ， 张志博 ， 朱石荻 ， 刘欣彤 ， 刘义明 ， 徐 飞 ， 陈孝杰 ， 李秀波

(中国农业科学院饲料研究所 ， 北京 海淀 100044)

合理使用消毒剂做好畜舍和生活环境的净化消毒，对阻止疫病的传播和扩散尤为重要[1]，做好畜禽圈舍及环境消毒是畜牧业健康发展的关键[2]。养殖场消毒中传统的次氯酸盐消毒剂对设备有腐蚀，且刺激性强，新型次氯酸消毒剂因浓度低、无残留、低腐蚀性等优点越来越得到重视[3]，有报道表明，现场制备的弱酸性次氯酸水在养殖环境和圈舍消毒方面表现良好[4-5]。本试验参照《兽用消毒剂鉴定技术规范》[6]和《消毒技术规范》[7]，设计了悬液定性、定量杀菌试验和畜舍现场消毒试验，对本实验室研制的一种瓶装次氯酸消毒剂的杀菌效力进行科学系统的评价，为其作为新兽药的申报和兽医临床的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂 次氯酸消毒剂由中国农业科学院饲料研究所提供，批号：200820；选择某兽用次氯酸钠消毒剂，市面上购买，批号：20200501。现场试验用畜舍4 m2/个，水泥地面；试验用大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)8099和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)ATCC6538，均购自广东环凯微生物科技有限公司；乙型溶血性链球菌(Beta-hemolyticStreptococcus,S.hemolysis)32210和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)63501，均购自中国医学微生物菌种保存管理中心；硫代硫酸钠容量分析用溶液(0.101 0 mol/L，批号：5451)，购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；可溶性淀粉、碘化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和吐温-80(均为分析纯)，均购自国药集团化学试剂有限公司；藏红T和孔雀石绿(生物染色剂)，均购自国药集团化学试剂有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基(Trypytic soy agar，TSA)和LB培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；小牛血清，购自广州蕊特生物科技有限公司。

1.2 仪器 SW-CJ-2FD型洁净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；ME203E/02型电子天平，购自梅特勒—托利多仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 有效氯含量测定 以有效氯含量作为评价含氯消毒剂浓度的指标，参照卫生部2018年发布的《含氯消毒剂卫生要求》[8]中的方法测定有效氯含量。

1.3.2 细菌悬液制备 取冻干菌种增菌，单菌落传代，单菌落接种液体培养基，37 ℃培养18～24 h得到细菌悬液，稀释成106～107CFU/mL菌悬液备用。

1.3.3 中和剂鉴定试验 以大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌为指示菌。中和剂采用含硫代硫酸钠、吐温-80的LB肉汤，磷酸盐缓冲液稀释菌悬液，无菌硬水稀释消毒剂。参照《兽用消毒剂鉴定技术规范》[6]设计6组试验，试验分组及评价标准见表1。

按照公式(1)计算误差率。

PX/%=∑|X-Xi|÷∑Xi×100%

(1)

式中PX为组间菌落误差率；X为3组、4组、5组间菌落平均值；Xi为各组菌落平均数。

表1 中和剂鉴定试验分组及评价标准Table 1 Neutralizer identification test groups and evaluation criteria

1.3.4 悬液定性杀菌试验 参照《兽用消毒剂鉴定技术规范》[6]，每种消毒剂按有效氯含量稀释成125、100、75、50、25、12.5、6.25 mg/L和3.125 mg/L共8个浓度，选取1、5、10、15、30 min和60 min共6个时间点进行试验。

1.3.5 悬液定量杀菌试验 参照《兽用消毒剂鉴定技术规范》[6]和定性试验结果初步确定消毒剂作用时间和浓度，参照公式(2)计算杀灭对数。平均杀灭对数≥3，杀毒效能有效[7]。

杀灭对数=原菌液平均活菌浓度的对数(N0)-消毒剂处理组活菌浓度的对数(Nx)

(2)

1.3.6 畜舍现场消毒试验 次氯酸消毒剂设置高浓度(150 mg/L)、中浓度(75 mg/L)、低浓度(50 mg/L)，次氯酸钠消毒剂按推荐剂量1∶100稀释后有效氯含量为486 mg/L，用自来水代替消毒剂同步试验，作为阴性对照，进行自然菌的现场消毒试验、对特定菌的现场消毒试验和畜舍空气现场消毒试验。试验前对畜舍冲洗除污，自然干燥后备用。对特定菌的现场消毒试验提前将制备菌液均匀涂于采样部位，保证采样部位含菌量为105～106CFU，自然晾干后进行试验，对自然菌的现场消毒试验和畜舍空气现场消毒试验无此操作。消毒时使用喷雾器喷洒整个畜舍，包括畜舍内空气。采样位置：每个浓度每次使用3个圈舍作为平行，试验前在空圈舍地面、栏杆、食槽用记号笔分别标记出5 cm×5 cm区域的采样部位，要求采样部位相邻而不相同，结果取平均值；采样方法：无菌棉拭子浸润中和剂后，在采样区域横竖各用力擦拭10次，并不断转换拭子擦拭面，将拭子棉花端剪入无菌离心管内，封好；采样时间：消毒前、消毒后10、20、30 min和60 min。检测方法：样品用无菌磷酸盐缓冲液充分洗脱后梯度稀释，在LB琼脂平皿或含5%小牛血清的TSA琼脂平皿均匀涂布，活菌计数培养。在做表面消毒的同时进行空气消毒试验，采用自然沉降法，时间点同上。将含5%小牛血清的TSA平皿均匀放置在畜舍不同位置敞口5 min，实验室培养计数。参照《消毒技术规范》[7]，现场消毒试验对环境自然菌的杀灭对数≥1，对特定菌的杀灭对数≥3，可判为消毒合格。

2 结果

2.1 中和剂鉴定试验 由表2可知，5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L吐温-80+20 g/L肉汤作为中和剂，1组、2组、6组无菌生长，E.coli和B.subtilis分别作为指示菌的3组、4组、5组间菌落数误差率分别为1.21%和13.50%，均低于15%，可判定该中和剂能有效中和消毒剂，且对E.coli和B.subtilis生长均无影响。

表2 中和剂鉴定试验Table 2 Neutralizer identification test

2.2 悬液定性杀菌试验 由表3、表4可知，室温作用1 min，次氯酸消毒剂完全杀灭E.coli所需有效氯含量最低为25 mg/L，完全杀灭S.aureus和S.hemolysis的最低有效氯含量均为75 mg/L；次氯酸钠消毒剂完全杀灭S.aureus的最低有效氯含量为25 mg/L，完全杀灭E.coli和S.hemolysis所需有效氯含量最低为50 mg/L；2种消毒剂对B.subtilis作用5 min，完全杀灭B.subtilis的最低有效氯含量分别为75 mg/L和125 mg/L。初步确定定量杀菌试验消毒剂有效氯含量选择6.25～125 mg/L。

表3 次氯酸消毒剂对细菌的定性杀菌效力Table 3 Qualitative bactericidal efficacy of hypochlorous acid disinfectant on bacteria

表4 次氯酸钠消毒剂对细菌的定性杀菌效力Table 4 Qualitative bactericidal efficacy of sodium hypochlorite disinfectant on bacteria

2.3 悬液定量杀菌试验 如图1所示，当有效氯含量为3.125 mg/L时，对E.coli，次氯酸消毒剂作用2 min杀灭对数达3以上，而次氯酸钠消毒剂则需5 min；对S.aureus，次氯酸消毒剂的最短有效杀灭时间为2 min，次氯酸钠消毒剂则为30 min；对S.hemolysis，次氯酸消毒剂作用60 min杀灭对数达6以上，次氯酸钠消毒剂无有效消毒效能；对B.subtilis，2种消毒剂最短有效杀灭时间均为10 min。

图1 有效氯含量3.125 mg/L的2种消毒剂对细菌的定量杀菌效力Fig.1 Quantitative bactericidal efficacy of two disinfectants containing 3.125 mg/L of available chlorine on bacteria

2.4 畜含现场消毒试验

2.4.1 对自然菌的现场消毒 由表5可知，次氯酸消毒剂有效氯含量为75 mg/L和150 mg/L时，消毒10 min，对畜舍不同位置自然菌的杀灭对数达1以上；次氯酸消毒剂有效氯含量为50 mg/L时，消毒10 min，对栏杆和食槽上自然菌的杀灭对数在1以上，对地面自然菌的杀灭对数低于1。次氯酸钠消毒剂使用推荐浓度(486 mg/L)，在不同作用时间对栏杆、食槽和地面上自然菌的杀灭对数均在1以上。

表5 2种消毒剂作用不同时间对畜舍不同位置自然菌的消毒效果Table 5 Disinfection effect of two disinfectants on natural bacteria in different positions of livestock houses at different time

2.4.2 对特定菌的现场消毒 由表6可知，次氯酸消毒剂中浓度(75 mg/L)与次氯酸钠消毒剂推荐浓度(486 mg/L)对不同位置特定菌作用10 min，杀灭对数均在3以上。

表6 次氯酸消毒剂中浓度(75 mg/L)和次氯酸钠消毒剂推荐浓度(486 mg/L)对畜舍不同位置特定菌的消毒效果对比Table 6 Comparison of the disinfection effect of hypochlorous acid disinfectant medium concentration (75 mg/L) and sodium hypochlorite disinfectant recommended concentration (486 mg/L) on specific bacteria in different positions of livestock houses

2.4.3 畜舍空气现场消毒 由图2可知，次氯酸消毒剂中浓度(75 mg/L)和高浓度(150 mg/L)对空气中自然菌的杀灭对数均在1以上，次氯酸消毒剂低浓度(50 mg/L)作用20 min消毒效果最好，杀灭对数在1以上，次氯酸钠消毒剂推荐浓度(486 mg/L)杀菌对数不能稳定在1以上。

图2 2种消毒剂对畜舍空气中自然菌的消毒效果Fig.2 Disinfection effect of two disinfectants on natural bacteria in the air of livestock houses

3 讨论

市面上常用的含氯消毒剂多以次氯酸钠消毒剂为主，广泛应用于家庭、食品、医疗、物流等多种领域[9]，但次氯酸盐类消毒剂使用后会有钠、钙等金属盐离子残留，可能会污染消毒物品表面。本试验研究的次氯酸消毒剂见光易分解，使用无残留，无需清洗[10]。本产品是本实验室制备的次氯酸瓶装溶液剂成品，杀菌效力稳定，适用于家庭等小规模、间断性场景，使用方便，操作简单，弥补了目前市面上使用次氯酸消毒剂时需借助次氯酸发生器现用现制[10-11]的短板。

对于本消毒剂多项杀菌力评价试验显示，与次氯酸钠消毒剂相比，次氯酸消毒剂对多种自然菌和特定菌有效杀灭浓度更低，杀菌速度更快，且75 mg/L次氯酸消毒剂即可达到与486 mg/L次氯酸钠消毒剂相同的消毒效果。

全国消毒产品网上备案信息服务平台信息显示[12]，2020年1月1日之后备案的次氯酸消毒剂数量激增，次氯酸消毒剂越来越受到人们的认可，相信未来该新型次氯酸消毒剂会在越来越多场景中使用。