一步法构建鸡传染性贫血病毒感染性克隆

陈俊成 ， 袁 栩 ， 马子月 ， 李晓齐 ， 曹 红 ， 王永强 ， 郑世军 ， 高 丽

(中国农业大学动物医学院农业农村部动物流行病学重点实验室 ， 北京 海淀 100193)

鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia，CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)引起的一种禽免疫抑制病[1]。雏鸡感染CIAV后胸腺细胞和骨髓中成红细胞被破坏，造成严重的免疫抑制和贫血[2-3]，这不仅会降低疫苗对雏鸡的保护作用，导致雏鸡死亡率增高，还会降低饲料转化率以及肉鸡的生产性能，对家禽产业产生巨大的经济影响[4-5]。CIAV属于指环病毒科 (Anelloviridae) 环病毒属 (Gyrovirus)，病毒基因组为环状单链DNA，编码3种病毒蛋白：VP1、VP2和VP3。VP1是唯一的结构蛋白，可结合病毒中的ssDNA[6]； VP2是一种双特异性蛋白质磷酸酶，在病毒粒子组装过程中主要起到脚手架蛋白的作用[7]； VP3又称凋亡素，可诱导淋巴细胞与骨髓造血母细胞凋亡，最终导致鸡出现贫血和免疫抑制[8]。

反向遗传技术已广泛应用于各种DNA病毒，该技术通过将DNA病毒的全长基因组克隆入质粒载体从而获得感染性克隆，然后将感染性克隆转染细胞拯救获得重组病毒[9-10]。由于CIAV是环状病毒，直接将全基因组DNA插入质粒后转染细胞并不能得到重组病毒。目前多先通过分段获得CIAV基因组，连接得到线性全长基因组后，继而连接载体并通过酶切环化得到病毒环状基因组[11]； 此外，还可在载体中加入重复的两端CIAV基因组[12]。但上述方法需要进行多次酶切、连接、单克隆鉴定、测序等复杂程序，耗时较长。本试验通过优化PCR反应条件，一次性扩增出CIAV全基因组，并通过引物设计使CIAV基因组两端带有与载体相同酶切位点的同源臂，使用同源重组技术将病毒基因组嵌合入载体中，提高了CIAV感染性克隆构建的效率，为进一步研究CIAV的致病机制和研发新型疫苗提供了试验基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株和质粒 CIAV Cux-1毒株，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所杨兵研究员馈赠；质粒pcDNA3.1，由本实验室保存；鸡淋巴瘤细胞MDCC-MSB1，购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)；大肠杆菌感受态菌株Trans-T1，购自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 DNA 凝胶回收试剂盒和无内毒素质粒小提试剂盒，均购自广州美基生物科技有限公司；病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；LATaq酶、限制性内切酶和Solution I连接酶，均购自日本 TaKaRa公司；2×Basic Assembly Mix(同源重组酶)，购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖，购自北京盛旭百川生物科技有限公司；100×非必需氨基酸和胎牛血清，均购自美国 Gibco 公司；低熔点琼脂，购自北京博奥拓达科技有限公司；核酸分子量标准(DNA Marker)，购自北京中科瑞泰生物科技有限公司；核酸染料 Gold View、HRP标记山羊抗小鼠IgG、FITC 标记山羊抗鼠 IgG，均购自北京鼎国生物技术有限责任公司；CIAV VP2 3D7株单克隆抗体，由本实验室制备。

1.3 主要仪器 电泳成套设备，北京东方瑞利科技有限公司；台式电子天平，德国Sartorius公司；高压蒸气自动灭菌器，日本电气公司；-80 ℃超低温冰箱，美国Forma Scientific公司；低温冷冻高速离心机，德国Eppendorf 公司；凝胶成像分析系统，美国Alpha公司；超净工作台，中国苏州净化设备厂；透射电子显微镜，日本Hitachi 公司；CO2培养箱，美国Thermo公司；倒置显微镜，中国重光公司；Bio-Rad电穿孔仪，美国伯乐公司。

1.4 试验方法

1.4.1 DNA提取 将CIAV Cux-1株病毒接种MDCC-MSB1细胞，用含有2%胎牛血清的RPMI 1640培养基维持培养24 h，收取细胞与细胞上清并反复冻融3次，经3 000 g离心2 min后取上清，用病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒提取DNA。

1.4.2 CIAV全长基因组的克隆 根据CIAV Cux-1株基因序列 (GenBank登录号:M55918.1)及 pcDNA3.1质粒多克隆位点设计带有同源臂和酶切位点的引物(表1)，并由北京擎科生物科技有限公司合成。以病毒基因组DNA为模板，以CIAV-AflⅡ-F/R为引物，用LATaq酶进行PCR扩增。PCR反应体系：2×High Fidelity Master Mix 25 μL，模板 5 μL，上、下游引物各 2 μL，ddH2O 13.5 μL，DMSO 2.5 μL；PCR反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环；72 ℃终延伸5 min。用DNA 凝胶回收试剂盒对PCR产物回收和纯化。

表1 病毒基因组扩增引物(基于Cux-1毒株)Table 1 Primers for viral genome amplification (based on Cux-1 strain)

1.4.3 嵌合CIAV Cux-1株全长基因组重组质粒的构建 用AflII内切酶酶切pcDNA3.1载体，回收纯化酶切后产物。应用同源重组酶将病毒基因组DNA与线性化pcDNA3.1载体同源重组，从而将病毒基因组DNA全长嵌合入载体中。同源重组体系：2×Basic Assembly Mix 5 μL，目的基因 3.5 μL，线性化载体 1.5 μL；反应条件：50 ℃ 30 min，4 ℃保存。同源重组产物转化感受态细胞Trans-T1，进一步通过菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定，将测序正确的质粒命名为pcDNA3.1-Cux-1。

1.4.4 CIAV全长基因组的环化 对重组质粒pcDNA3.1-Cux-1 进行AflⅡ单酶切，酶切体系：AflⅡ限制性内切酶 1 μL，10×buffer 5 μL，重组质粒 2 μg，ddH2O补充至50 μL。得到线性化CIAV Cux-1株全基因组，其两端携带有互补的黏性末端。酶切产物经回收和纯化后，通过SolutionⅠ连接酶连接得到 CIAV Cux-1 环状DNA。

1.4.5 重组病毒rCux-1的拯救 为区分重组病毒与亲本病毒，将重组病毒命名为rCux-1。CIAV Cux-1环状DNA电转染 (220 V，10 ms)导入MDCC-MSB1细胞。转染后细胞置于含10%胎牛血清、无抗生素的RPMI 1640培养基中，48 h后对细胞反复冻融3次，离心收获上清液并通过0.45 μm滤器过滤，将滤液按1∶10接种MDCC-MSB1细胞进行连续传代。

1.4.6 重组病毒rCux-1的鉴定

1.4.6.1 PCR鉴定 当病毒连续传代至第3、4、5代时，通过病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒提取病毒DNA，使用CIAV-298-F/R引物进行PCR扩增CIAVvp2保守区。

1.4.6.2 Western blot检测VP2蛋白 当病毒连续传代至第8代时，用RIPA裂解液裂解细胞收获细胞总蛋白，经12% SDS-PAGE后转印至PVDF膜，以CIAV VP2 3D7株单抗为一抗(1∶1 000)，以HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗(1∶10 000)；使用化学发光法进行曝光。

1.4.6.3 间接免疫荧光检测VP2蛋白 当病毒连续传代至第8代时，离心收集MDCC-MSB1细胞，并用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗涤2次，每次1 min;以适量PBS重悬细胞，将细胞涂于载玻片，室温干燥；用丙酮-乙醇(体积比为1∶1)4 ℃固定15 min;37 ℃、1% BSA封闭2 h；向细胞涂片滴加CIAV VP2 3D7株单抗稀释液(1∶100)，37 ℃孵育1 h；用PBS室温洗涤3次，每次5 min；向细胞涂片滴加 FITC 标记山羊抗小鼠 IgG(1∶100)，37 ℃孵育30 min;用PBS室温洗涤3次，每次5 min；室温干燥后在荧光显微镜下观察。

1.4.7 重组病毒遗传标志鉴定 将第9代病毒液根据病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒说明书提取病毒DNA，通过CIAV-short-F/R引物进行PCR扩增，得到的产物进行AflⅡ酶切鉴定。

1.4.8 建立病毒拷贝数定量PCR(qPCR)标准曲线 计算包含CIAVvp2保守区的重组质粒摩尔浓度，以10倍浓度梯度稀释的质粒作为模板，使用CIAV-298-F/R引物进行qPCR扩增，以Ct值对应质粒拷贝数作标准曲线。其公式为LogYCt=LogX+Ct×Log(1+E)，其中YCt为第Ct个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为扩增效率，Ct为扩增循环数。

1.4.9 CIAV复制曲线的测定 将重组病毒与亲本病毒按照感染复数(MOI)为1分别感染处于对数生长期的MDCC-MSB1细胞，在感染后的0、6、12、24 h 和48 h反复冻融裂解细胞，并离心收获上清液，保存于-80 ℃。提取病毒DNA，进行qPCR扩增，通过1.4.8建立的标准曲线计算CIAV拷贝数，绘制病毒生长动力学曲线。qPCR反应体系：2×M5 HiPer SYBR Premix 10 μL，模板 2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 7.2 μL；qPCR反应条件：98 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，共40个循环；熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s；50 ℃降温30 s。

1.5 CIAV感染性克隆构建流程 CIAV感染性克隆构建流程如图1所示。

图1 感染性克隆构建流程Fig.1 Flow chart of infectious clone construction

2 结果

2.1 CIAV全长基因组的克隆 以CIAV Cux-1毒株感染MDCC-MSB1后提取的DNA为模板，采用同源臂扩增引物CIAV-AflⅡ-F/R经PCR扩增获得两端带有同源臂的CIAV基因组，片段大小为2 355 bp，与预期大小一致(图2A)。

2.2 pcDNA3.1-Cux-1重组质粒的构建与鉴定 pcDNA3.1载体经AflⅡ限制性内切酶单酶切后线性化(图2B)，与带有同源臂的CIAV基因组进行同源重组，转化后挑取测序正确的质粒，命名为pcDNA3.1-Cux-1。测序结果显示，除两端带AflII酶切位点外，质粒pcDNA3.1-Cux-1中插入的CIAV基因序列与亲本病毒完全相同。

图2 CIAV Cux-1全长基因组PCR扩增(A)与pcDNA3.1载体线性化(B)Fig.2 PCR amplification of CIAV Cux-1 full-length genome (A) and linearization of pcDNA3.1 vector (B)M:DNA标志物(DL2 000 plus)； 1～2:Cux-1毒株样品； 3～4:pcDNA3.1载体经Afl Ⅱ限制性内切酶酶切产物M:DL2 000 plus DNA Marker; 1-2:Cux-1 strain samples； 3-4:pcDNA3.1 vector digested by Afl Ⅱ restriction endonuclease

2.3 CIAV环状全长基因组的构建 利用AflⅡ限制性核酸内切酶位点将CIAV全长基因组从pcDNA3.1-Cux-1质粒上切割下来，电泳条带分别为2 350 bp和5 500 bp左右(图3)，与预期大小一致。回收并纯化2 350 bp左右的条带，通过Solution Ⅰ 连接酶将线性DNA环化，得到CIAV Cux-1环状基因组。

图3 CIAV全长基因组的环化Fig.3 Cyclization of full-length CIAV genomeM:DNA标志物(DL2 000 plus)； 1:质粒pcDNA3.1酶切后样品； 2:质粒pcDNA3.1-Cux-1酶切后样品M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Plasmid pcDNA3.1 samples after enzyme digestion; 2:Plasmid pcDNA3.1-Cux-1 samples after enzyme digestion

2.4 重组病毒rCux-1的鉴定 将CIAV Cux-1环状基因组通过电转染方式导入MDCC-MSB1细胞，并进行连续传代。通过PCR检测第3、4、5代细胞，结果如图4所示，病毒DNA均能被检测到，表明病毒可进行传代。将rCux-1传至第8代时，Western blot检测结果显示，CIAV感染MDCC-MSB1细胞24 h后，亲本病毒和重组病毒均能检测到VP2蛋白，而对照细胞无法检测到VP2蛋白(图5)，表明重组病毒rCux-1能够正常表达蛋白。同时应用间接免疫荧光检测细胞内VP2蛋白，结果显示，亲本病毒和重组病毒均可检测到特异性的绿色荧光，而对照细胞无法检测到特异性的绿色荧光(图6)。

图4 重组病毒的PCR鉴定Fig.4 PCR identification of the recombinant virusM:DNA标志物(DL2 000 plus)； 1:空白对照； 2:阴性对照； 3:第3代重组病毒rCux-1； 4:阴性对照； 5:第4代重组病毒rCux-1； 6:阴性对照； 7:第5代重组病毒rCux-1M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Blank control; 2:Negative control; 3:3rd recombinant virus rCux-1; 4:Negative control; 5:4th recombinant virus rCux-1; 6:Negative control; 7:5th recombinant virus rCux-1

图5 免疫印迹检测病毒VP2蛋白Fig.5 Immunoblot detection of viral VP2 protein1:阴性对照； 2:亲本病毒Cux-1； 3:重组病毒rCux-11:Negative control; 2:Parental virus Cux-1; 3:Recombinant virus rCux-1

图6 间接免疫荧光检测细胞内VP2蛋白Fig.6 Indirect immunofluorescence detection of intracellular VP2 proteinA～C：阴性对照； D～F：亲本病毒Cux-1； G～I：重组病毒rCux-1A-C：Negative control; D-F：Parental virus Cux-1; G-I：Recombinant virus rCux-1

2.5 重组病毒遗传标志的鉴定 将rCux-1传至第9代，应用PCR技术扩增带有AflⅡ酶切位点遗传标记的序列，电泳结果显示，目的条带大小为736 bp，与预期大小一致(图7)。用限制性内切酶AflⅡ对目标序列进行单酶切，电泳结果显示，亲本毒株Cux-1 PCR产物未被切开，而重组毒株rCux-1 PCR产物切开后得到2条大小为360 bp左右的条带(图8)，表明获得的重组病毒rCux-1带有特定遗传标记，为感染性克隆构建所得重组病毒。

图7 重组病毒的PCR鉴定Fig.7 PCR identification of the recombinant virusM:DNA标志物(DL2 000 plus)； 1:空白对照； 2:阴性对照； 3:亲本病毒Cux-1； 4:重组病毒rCux-1M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Blank control; 2:Negative control; 3:Parental virus Cux-1; 4:Recombinant virus rCux-1

图8 亲本病毒和重组病毒PCR产物的酶切鉴定Fig.8 Identification of PCR products of the parental and recombinant virus by enzymatic digestionM:DNA标志物(DL2 000 plus)； 1:亲本病毒 PCR产物酶切后样品； 2:重组病毒PCR产物酶切后样品M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Sample of parental virus PCR product after enzymatic digestion; 2:Sample of recombinant virus PCR product after enzymatic digestion

2.6 病毒复制曲线分析 为比较重组病毒rCux-1与亲本病毒的复制能力和增殖特性是否发生变化，将rCux-1传至第9代后检测病毒感染MDCC-MSB1细胞后不同时间点的病毒拷贝数并绘制病毒生长曲线，发现二者生长趋势一致(图9)，表明重组病毒复制能力和增殖特性与亲本Cux-1株基本相同，可用于后续研究。

图9 亲本病毒Cux-1和重组病毒rCux-1的生长曲线Fig.9 Growth curves of parental virus Cux-1 and recombinant virus rCux-1

3 讨论

CIAV是一种重要的禽类免疫抑制病病毒，该病毒于1979年由Yuasa等学者首次报道[3]。随后发现CIAV在世界各地的家禽场中普遍存在，我国于1992年在黑龙江省首次分离到该病毒[13-15]。目前，CIAV在我国广泛流行[15]，严重危害养禽业发展，但目前尚没有有效的疫苗防控该病，针对CIAV的减毒活疫苗免疫后诱导的抗体效价较低，仅能提供中等保护[16]，因此深入研究CIAV致病机制对于制备新型的亚单位疫苗或DNA疫苗具有重要意义。

反向遗传操作是病毒研究的重要方法，为深入研究病毒致病分子机制以及研制疫苗奠定了基础[17]。为快速构建CIAV反向遗传平台，本试验采用一步法扩增CIAV全基因组，在同源重组酶的作用下连接病毒基因和线性化的质粒，得到重组质粒。重组质粒中CIAV全基因组两端的同源臂上具有相同的酶切位点，单酶切后可在体外使用T4 DNA连接酶将其环化，得到环状的CIAV全基因组。

将环状的CIAV基因组电转染入MDCC-MSB1细胞中，盲传3代后开始提取病毒DNA，连续检测第3～5代病毒DNA，发现在连续传代后仍能够检测到病毒，初步表明病毒拯救成功。本试验在病毒传至第8代时收取了细胞与蛋白，使用VP2单克隆抗体，分别通过间接免疫荧光和Western blot进行鉴定，发现均能检测到VP2蛋白。为进一步探究重组病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性，比较重组病毒第9代rCux-1与亲本病毒第9代Cux-1的生长动力曲线，结果表明重组毒株与亲本毒株增殖能力基本一致。最后，以第9代病毒的DNA为模板，通过PCR扩增其遗传标记，经酶切鉴定为阳性，表明一步法构建CIAV感染性克隆平台准确有效。

本试验感染性克隆构建的关键在于得到病毒环状DNA，CIAV基因组的长度较短(约2.3 kb)，为共价闭合环状单股负链DNA。相比于其他方式如分段扩增等[11-12]，本试验在高保真DNA聚合酶作用下一步得到病毒全基因组，缩短了构建时间，并且是非载体依赖的分子克隆，更易于转染入细胞得到病毒。

综上所述，本试验成功构建了CIAV感染性克隆，为今后对CIAV进行致病机制研究提供了试验基础，也将为开展基因工程疫苗研究提供平台。