脂肪酸合成酶在乳腺浸润性微乳头状癌中的表达及作用研究*

张婧越 吴开良 吕鉴可 付丽

浸润性微乳头状癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）是一种特殊的病理组织学类型。IMPC 细胞呈桑葚样、集团性排列、生长，上皮标志物EMA 着色于IMPC 细胞团的外表面[1]。IMPC 具有高淋巴结转移、高脉管侵犯等特征，且高复发、高转移[2]。本课题组前期行空间转录组测序结果显示，与浸润性导管癌-非特殊类型（invasive ductal carcinoma,no special type,IDC-NOS）相比，脂质合成的关键基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）在IMPC 中表达显著上调[3]。国内外多项研究表明，FASN 在多种恶性肿瘤中表达升高，与癌症的不良预后相关[4-6]。本研究旨在通过分析FASN 在IMPC 中的表达与功能，为乳腺IMPC 的预后评估提供新的生物学标志物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 选取2010 年1 月至2015 年12 月天津医科大学肿瘤医院收治的171 例IMPC 及159例IDC-NOS 乳腺癌手术病例，所有患者术前均未行新辅助化疗及放疗。采用倾向性评分匹配法（PSM）以1∶1 对IMPC 与IDC-NOS 行最近邻匹配（容差值为0.02），以分类变量是否年龄＞50 岁，TNM 分期中的T、N 分期为预测变量，标准化差异法评价两组基线资料的均衡性，匹配后分为105 例IMPC 组和105例IDC-NOS 组。

1.1.2 细胞和试剂 乳腺癌T47D 细胞株购自中国PROCELL 公司。慢病毒载体构建和包装由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 所有组织标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm 厚度切片，检测组织中的FASN 表达[7]。结果判定由两名经验丰富的病理医师采用双盲法独立判读。FASN 蛋白主要表达在肿瘤细胞细胞质中，免疫组织化学法染色强度可分为0（无可检测的染色）、1+（弱染色）、2+（中度染色）和3+（强染色）。阳性细胞＜5% 计为0，6%～25% 计为1+，26%～50%计为2+，51%～75%计为3+，76%～100%计为4+。计算H 分数=Pi（i+1），其中i 代表肿瘤细胞的着色强度（0～3+），Pi 代表肿瘤细胞染色阳性的百分比。截断值设置为150%，截断值≥150%为FASN高表达，截断值＜150%为FASN 低表达。

1.2.2 细胞培养及转染 在37℃、5%CO2培养箱中对T47D 细胞进行培养，待细胞密度达到70%左右时进行转染。构建干扰FASN 表达的慢病毒PLKO.1-FASN-sh1、sh2 实验组和转染空载体PLKO.1-shGFP 阴性对照组。

1.2.3 CCK8 细胞增殖实验 将细胞重悬，调整细胞密度为5×104/mL，取0.5 mL 细胞悬液接种于24 孔板中。从第0 天开始，每日向待测孔中加入10 μLCCK8试剂，孵育3～4 h，检测450 nm 处吸光度（OD）值。

1.2.4 划痕实验 待单层贴壁细胞长满后，使用10 μL无菌枪头在每孔平行划3 条直线，分别于0、12、24 h镜下观察各组划痕并拍照。采用Image J 软件分析统计各时期划痕的平均宽度值。

1.2.5 蛋白免疫印迹实验 提取细胞总蛋白，SDSPAGE 电泳、封闭、加一抗（稀释浓度1∶1 000），4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL 化学发光法检测蛋白表达。

1.2.6 随访 通过查询电子病历、复查影像学信息及致电询问的途径对患者随访，截止2022 年3 月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。计数资料采用t检验法，计量资料采用非参数检验法。采用Kaplan-Meier 法进行生存曲线分析，采用Cox 比例风险回归模型分析法进行单因素和多因素分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PSM 后乳腺 IMPC 与IDC-NOS 临床病理学特征的对比

所有IMPC 患者均经EMA 染色验证（图1，2）。PSM 后105 例患者的分析结果显示，IMPC 组的淋巴管癌栓和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）阳性率显著高于IDCNOS 组（P＜0.05）；FASN 在IMPC中的高表达为61.0%（64/105），显著高于IDC-NOS 的31.4%(33/105)，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.001，表1）。FASN在IMPC 和IDC-NOS 肿瘤组织中均定位于细胞质，在IMPC 组织中FASN 多呈棕褐色，尤其在IMPC 肿瘤细胞团近间质侧相对深着色，而在IDC-NOS 组织中多为较浅着色（图3）。

图3 免疫组织化学法检测FASN 在IMPC 及IDC-NOS 中的表达（SP×400）

表1 PSM 后IMPC 组和IDC-NOS 组基线情况比较

图1 镜下检查IMPC 形态特征（H&E×400）

图2 免疫组织化学法检测EMA 表达（SP×400）

2.2 FASN 在IMPC 中的表达及与临床病理学特征的相关性

IMPC 中FASN 的表达与患者脉管癌栓、N 分期及Ki-67 表达呈正相关（P＜0.05，表2）。

表2 FASN 表达与IMPC 临床病理学特征的相关性

2.3 乳腺IMPC 患者预后分析

Kaplan-Meier 生存曲线分析发现，FASN 高表达的IMPC 患者无病生存（disease-free survival,DFS）期和总生存（overall survival,OS）期显著短于FASN 低表达者（P=0.004 和P=0.007，图4）。单因素和多因素分析显示，FASN 高表达是IMPC 患者OS、DFS 降低的独立危险因素（P＜0.05，表3,4）。

表3 IMPC 患者DFS 的单因素及多因素分析

图4 FASN 对IMPC 患者的预后影响

表4 IMPC 患者OS 的单因素及多因素分析

2.4 FASN 诱导上皮间质转化促进乳腺癌细胞系增殖、迁移

利用慢病毒稳转T47D 细胞构建shFASN 细胞模型（图5A），shRNA 引物序列见表5。实验组（sh1、sh2）细胞增殖、迁移能力均显著下降（P＜0.001，图5B～D），其上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白E-cadherin 表达上调，N-cadherin 表达下调，Wnt/β-catenin 信号通路的主要信号分子Cyclin D1、C-myc 蛋白表达下调（图5E）。

图5 FASN 对乳腺癌T47D 细胞增殖迁移能力的影响

表5 shRNA 引物序列

3 讨论

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，是除肺癌外死亡率最高的恶性肿瘤，造成肿瘤患者死亡的主要原因是肿瘤的侵袭转移[8]。乳腺IMPC 具有高淋巴结转移、高淋巴管浸润等不良生物学行为，且预后极差[1,9]。FASN 是长链脂肪酸从头合成的关键酶，是癌细胞获得脂肪酸的重要来源[10]。本研究显示，FASN 在IMPC 表达显著高于IDC-NOS，并具有在IMPC 肿瘤细胞团中靠近间质侧的FASN 表达相对较高，而在内侧表达相对低的特点，提示FASN 在IMPC “集团性”侵袭、转移过程中可能发挥重要作用。本研究还发现，FASN 表达与IMPC 患者淋巴结转移和脉管癌栓阳性率呈正相关，提示FASN 是否与IMPC 细胞的嗜淋巴结转移、嗜脉管侵袭密切相关，其潜在机制还有待进一步研究。

本研究提示，FASN 高表达可作为预测IMPC 患者DFS 和OS 的独立危险因素。精准的诊疗是改善IMPC 患者预后的必要前提[11]，而IMPC 的精准诊治需要有效治疗靶点的发现。近年来，已有大量研究发现FASN 与多种癌症的预后相关，包括前列腺癌[5]、胆管癌[12]、肾透明细胞癌[6]。本研究中的部分细胞实验的意义，在于发现IMPC 组织中FASN 高表达可能是肿瘤发生、发展和影响预后的重要参与机制，提示FASN可作为IMPC 的潜在治疗靶点。

EMT 与肿瘤的发生有关、并赋予癌细胞转移特性[13]。EMT 的调控与多种信号通路密切相关，包括Wnt/β-catenin、表皮生长因子受体、转化生长因子（TGF）和Notch 通路[14]。研究表明，FASN 介导了卵巢癌细胞的EMT 过程，影响肿瘤的恶性进展[15]。但FASN 对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其调控机制还尚未明确。本研究证明FASN 能增强乳腺癌细胞的增殖、迁移能力，并发现shFASN 组细胞的上皮标志物E-cadherin 表达上调，间充质标志物N-cadherin 表达下调，提示FASN 在乳腺癌中诱导EMT，且Wnt/β-catenin 信号通路可能是FASN 调控乳腺癌EMT 进而促进乳腺癌增殖、迁移的潜在机制。

综上所述，FASN 可能通过Wnt/β-catenin 通路诱导EMT 发生，参与IMPC 的集团性侵袭、转移和淋巴管侵犯，其高表达是影响IMPC 患者预后的独立危险因素，可作为评估IMPC 临床预后的重要生物学标志物，为IMPC 诊断、靶向治疗和预后预测提供重要参考。但FASN 调控乳腺癌增殖、迁移的具体作用机制，还有待更为系统的深入研究。