规律血液透析患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测与思考

冯涛 张洁 徐媛琴 陈焱 王彩丽

调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）是一类能控制自身免疫反应的T 细胞亚群，CD4+CD25+Treg 作为最重要一类调节性T 细胞，是参与抑制自身反应性T 细胞的增殖，维持机体免疫耐受的重要因素[1]。Treg 表达的异常可能造成患者免疫功能的紊乱，是肾脏病患者容易合并严重感染、肿瘤等并发症的重要影响因素之一[2]。笔者希望通过本研究观察终末期肾脏病血液透析患者透析期间CD4+CD25+Treg 的水平及功能变化，寻找到一条改善血液透析患者免疫功能失调的道路，为提高血液透析患者生存质量提供新的治疗思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019 年1 月—2020 年12 月期间于包头医学院第二附属医院肾内科收治的20 例准备开始血液透析治疗的终末期肾病患者为观察组，男12 例，女8 例，年龄30～70 岁，平均（51.30±8.65）岁。纳入标准：（1）所有患者均符合慢性肾衰竭尿毒症的诊断标准，并被诊断为慢性肾衰竭尿毒症即血肌肝（serum creatinine，Scr）大于707 pmol/L；（2）患者纳入前未进行过肾脏替代血液透析治疗；（3）血糖、血压等并发症控制稳定；（4）患者及其家属知情了解并配合研究。排除标准：（1）肿瘤、全身免疫系统疾病；（2）近8 周内使用影响免疫功能药物；（3）近期患有急性感染性疾病、病情危重或存在严重心、肝、脑等多脏器功能衰竭以及血糖控制不佳的糖尿病患者；（4）出现严重并发症和不良事件、病情迅速恶化的，应及时中止试验。健康对照组20 例，均为健康志愿者，血清学及肝肾功能检查正常，排除存在系统疾病及肿瘤的人群，年龄30～70 岁，其中男、女各10 例，平均（49.10±9.33）岁。两组患者年龄、性别、尿毒症病程和肾衰病史等资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有临床可比性。研究经我院伦理委员会审核同意，所有参与患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

所有患者均行常规碳酸氢盐透析，透析时间4 h/次，3 次/周，使用低分子肝素钙（国药准字：H2006019，厂家：深圳赛保尔药业有限公司，剂量：5 000 U）抗凝，透析器膜为聚砜膜空心纤维透析器F15（厂家：山东威高血液净化制品股份有限公司，产地：山东威海），膜面积为1.5 m2，血流量200～250 ml/min，透析液流量500 ml/min，透析患者存在程度不等的肾性贫血，采用重组人红细胞生成素（国药准字：S20133011，厂家：深圳赛保尔药业有限公司，剂量：10 000 U）纠正贫血，剂量为50～150 U/（kg·w），钙磷代谢及全段甲状旁腺激素（Intact Parathyroid Hormone，iPTH）基本达标。

1.2.2 主要仪器和试剂

抗CD4 抗体（克隆号RPA-T4，荧光素BB515，货号564419，美国BD公司）、抗CD25抗体（克隆号M-A251，荧光素BV421，货号562442，美国BD 公司）、抗CD127 抗体（克隆号HIL-7R-M21，荧光素PE-Cy7，货号560822，美国BD 公司）。PBS（厂家：北京索来宝科技有限公司，规格：500 ml，货号：P1020，产地：北京）。流式细胞仪（美国BD 公司，型号BD FACSVerse）。采用自动生化分析仪检测患者血肌酐、尿素氮、血钙及血磷。采用购自美国R&D 公司的IL-10 试剂盒，酶联免疫吸附法检测血浆中IL-10 含量。

1.2.3 方法

用流式细胞术测定外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞，观察组分别于首次透析治疗前、规律透析6 个月的时间点采集当日透析前静脉血3 ml，对照组于入组当日，入组6 个月的时间点采集晨起空腹静脉血 3 ml，每管血给予相应编号；取外周血100 μl，每管加入相应的荧光素偶连抗体，包括抗CD4 抗体、抗CD25 抗体、抗CD127 抗体各1 μl，4℃避光染色30 min 后，加入2 ml 裂红液（实验室配置）裂红8 min，后加入2 ml PBS缓冲液混匀离心 500 g，5 min，弃去上清，加入1 ml 含1%多聚甲醛的PBS，室温孵育30 min 后离心500 g，5 min，弃上清液后300 μl 重悬上流式细胞仪检测，结果分析软件为FlowJo（发明人：Leonard Herzenberg，版本号：V10，产地：美国斯坦福大学）。

1.3 观察指标

观察组分别在透析首日以及透析6 个月，透析前进行抽血化验，并记录血清尿素氮、血肌酐、血钙、血磷、甲状旁腺功能以及IL-10 化验结果；流式细胞术检测CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞；而对照组不需要血液透析，只在实验首日及6 个月的相同时间点进行相同的化验；最后分别进行比较。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 23.0 统计学软件和Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析。计数资料用（n，%）表示，采用χ2检验；计量资料用（）表示，采用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。认为有统计学意义。结果以（）表示。

2 结果

2.1 肾功及钙磷代谢指标

观察组透析前血尿素氮、肌酐升高明显;且存在钙磷代谢紊乱，全段甲状旁腺激素超过正常3 倍。透析6个月各项指标得到一定程度的好转；对照组各项指标均在正常范围以内；见表1。

2.2 外周血IL-10 分布情况

观察组与对照组相比实验首日IL-10 含量百分比差异有统计学意义（t=16.77，P＜0.05）；观察组患者的IL-10 含量在治疗6 个月时较治疗前明显上升，差异有统计学意义（t=18.7，P＜0.05）；但治疗6 个月时观察组患者IL-10 含量仍然低于对照组水平，差异有统计学意义（t=8.53，P＜0.05），见表1。

表1 患者的临床资料（）

表1 患者的临床资料（）

2.3 外周血调节性T 细胞分布情况

图1 为真实实验时的情况，观察组与对照组中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的含量。图2 中，观察组患者血液透析前CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞比例（2.09±0.26）水平均低于对照组（8.45±1.06），差异有统计学意义（t=26.060，P＜0.05），见图2A；透析治疗6 个月后较治疗透析前CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞比例水平上升，差异有统计学意义（t=13.34，P＜0.05），见图2D。且治疗6 个月后，观察组患者CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞比例水平（3.50±0.36）仍低于对照组（7.87±1.34），差异有统计学意义（t=14.085，P＜0.05），见图2B；对照组CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞比例2 次结果无明显变化，见图2C。

图1 观察组与对照组中CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞的含量

图2 各组CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞的含量比较

3 讨论

1995 年首次发现 CD4+CD25+Treg 细胞，其来源于胸腺，是一类能够控制自身免疫应答及发挥免疫调节功能的细胞群[3]。2002 年正式定义 Treg 细胞是一种独立的具有调节功能的 T 细胞亚群。随后逐渐发现Treg 细胞的调节功能与细菌感染、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植耐受等疾病均相关。3 叉头状/翅膀状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor，Foxp3）目前发现的CD4+CD25+Treg 细胞分化过程中最好的标记物[4]。但由于Foxp3 存在于细胞浆内，需要破膜打孔后才能检测，很容易破坏细胞的活性，临床工作中不适合分选，如何选择更好的组合，获得更好的标志物，始终是一个问题。研究发现IL-7 的受体CD127 与Foxp3 的表达存在着关联性[5]。后来研究发现CD127 的高表达存在于CD4+T 细胞的整个细胞周期，与之相反，调节性T 细胞中CD127 却是一个低表达状态，因此在帮助识别调节性T 细胞和记忆性T 细胞表面标记物方面，CD127 发挥着重要的作用；并且进一步研究发现调节性T 细胞的细胞胞浆中Foxp3 与细胞胞膜中CD127 之间存在联系，即胞浆中Foxp3 的高表达（Foxp3high）与包膜中 CD127 的低表达（CD127low）可能密切相关且为同一细胞群，CD127 主要存在于正常人外周血中成熟的T 细胞表面；体外实验表明，具有抑制活性的调节性T 细胞表面的CD127 更容易被检测到。因此，目前认为CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞在临床应用中更具价值[6]。

在大多数炎性疾病（包括急性和慢性肾脏疾病）的研究中，Treg 的耗竭会加重疾病，而Treg 的补充可提供强有力的保护[7-9]。虽然肾脏只占身体重量的1%，但流入肾脏的血流能占到心输出量的25%，肾脏疾病会导致肾脏聚集大量体内代谢的物质，从而诱发肾脏炎性病变，肾脏炎性疾病的主要影响是血流，肾皮质（50 mmHg）和髓质（10～20 mmHg）之间的血流和氧分压差分布使得髓质对缺氧特别敏感[10-12]。肾脏疾病的发生往往继发于其他疾病，世界范围内糖尿病肾病一直是慢性肾衰竭的最大杀手；另外自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE），有一半的患者中表现为免疫复合物沉积相关的肾脏病，并且高达10%的患者出现肾功能衰竭[13]。还有其他一些肾脏疾病，如IgA 肾病、膜性肾小球病、局灶性节段性肾小球肾炎等，都因免疫系统而恶化，这些患者中有很大一部分进入终末期肾病[14]。上述疾病炎症在其发病过程中都起着重要的作用。因此，可以预见有效的干预炎症的策略对于肾脏病应该是有益的，而Treg 已经被证明防止免疫系统的过度激活最有力的执行者。然而终末期肾脏病患者与Treg 的相关性却很少有研究。终末期肾脏病由于多种毒素的存在，导致Treg 的耗竭，当Treg 减少时，对T 细胞和B 细胞抑制减弱，引导变化中的CD4+T 细胞成为致病性的T 细胞，导致尿毒症患者免疫功能受损或紊乱。另外其相关细胞因子TGF-β1、IL-10 等也可起到抑制炎性细胞因子和趋化因子产生的作用[15]。虽然持续血液透析治疗可以通过内毒素的清除，使终末期肾脏病患者的免疫缺陷状况得到部分改善。但比较于正常人群仍处于一个较为低下状态；从而，免疫功能缺陷已经成为严重威胁终末期肾病患者生命的重要因素之一。因此监测血液透析患者的免疫功能指标，对于判断病情发展趋势以及有效指导治疗至关重要。

笔者通过临床观察发现，终末期肾脏病患者通过规律血液透析治疗会改善生存质量，但透析期间，很多患者因感染疾病而导致的死亡的发生率仍然很高，是否间接也反应了透析并未根本纠正机体的免疫缺陷。本研究通过检测初始透析到透析半年以后这个阶段患者外周血中调节性T 细胞的分布，并且与正常健康人群相比较，发现患者首次透析前CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞及IL-10 的比例明显低下，证明终末期肾病患者可能存在免疫功能受损。维持性血液透析后上述项指标均较前有所上升，但比值仍明显低于正常人群，说明终末期肾病患者通过血液透析治疗后，机体的免疫功能得到了部分恢复，但仍不能恢复到正常健康人群水平。另外，摄入不足、血液透析中营养物质的丢失也可导致尿毒症透析患者细胞免疫功能低下，终末期肾病患者本身的原发病存在细胞免疫紊乱及免疫损伤也是导致免疫功能缺陷的重要原因，本研究尽量减少了这些影响因素。最终结果证实Treg 与慢性肾脏病密切相关，反映了终末期肾病患者体内可能的免疫低下的原因，以及血液透析可部分改善上诉情况，为通过血液透析改善调节免疫功能提供参考资料。