Survivin基因沉默对骨肉瘤裸鼠自噬相关蛋白的影响

白 星 周 娇 杜少蕊 田 昕

骨肉瘤是一种复杂的基因性疾病[1]，其转移率和病死率很高，常规治疗手段效果不佳[2]。既往研究结果显示，骨肉瘤的发生、发展与Survivin基因密切相关，抑制 Survivin 基因可影响骨肉瘤的细胞增殖、细胞凋亡以及侵袭和转移[3]。我们构建了重组腺病毒载体Survivin-shRNA，并通过皮下异种移植法构建裸鼠骨肉瘤模型，分析Survivin基因沉默对骨肉瘤裸鼠自噬相关蛋白LC3、P62与mTOR的表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验动物与试剂

MG-63细胞株来源于上海生命科学研究院细胞资源中心；LC3、P62、mTOR试剂购自美国Sigma公司，SPF级裸鼠共48只，购自于西安交大动物实验中心。整个实验过程符合《关于善待实验动物的指导性意见》(国家科学技术部，2006年颁布)标准。

1.2 裸鼠骨肉瘤模型的构建

构建Survivin-shRNA载体并转染至MG-63细胞，挑选转染稳定的细胞用于下一步实验。随机将其分为3组：CON组、GFP组、Survivin-shRNA组。取1×107单细胞悬液，加入50 ml PBS，先在5只裸鼠皮下注射，当裸鼠体内的肿瘤生长达到长径5 mm时切除。然后将瘤体切碎，组织块以1～2 mm3大小重新接种，即可获得裸鼠骨肉瘤模型。

1.3 肿瘤生长曲线的绘制

裸鼠肿瘤细胞接种完成后,逐日观察接种部位有无感染,肿瘤生长后有无自然消退，采用卡尺测定肿瘤体积，采用(长×宽)2/2即可计算出肿瘤体积，并据此绘制肿瘤生长曲线。

1.4 Western blot检测LC3、P62及mTOR蛋白表达

将裸鼠骨肉瘤组织标本切取后，机械研磨成细胞或组织碎片，PBS洗涤后离心沉淀，以5倍冰预冷的悬浮缓冲液分散细胞；离心10 min后吸出上清液移于试管中，沸水浴加热3 min，提取骨肉瘤组织蛋白。蛋白的表达水平根据GAPDH标化并通过软件进行灰度扫描、定量。

1.5 免疫组织化学法检测LC3、P62及mTOR蛋白表达水平

标本用4%多聚甲醛常规固定，蜡块制作并切片；分别加0.3%过氧化氢甲醇溶液30 min、0.3%Triton X-100 30 min、血清稀释液稀释的一抗，4℃ 24～48 h，然后加PBS稀释的二抗，室温孵育2 h，加ABC复合物，冲洗后加显色液进行免疫组织化学显色，裸鼠骨肉瘤组织标本切取后，用4%多聚甲醛常规固定，取材并置20%蔗糖溶液中过夜。蜡块制作、切片；加0.3%过氧化氢甲醇溶液30 min，PBS清洗；加配好的0.3%Triton X-100 30 min，PBS清洗；加血清稀释液稀释的一抗，4℃ 24～48 h，吸去抗体，PBS清洗；加PBS稀释的二抗，室温孵育2 h，PBS清洗；加ABC复合物，室温孵育2 h，PBS冲洗5 min×3，蒸馏水冲洗3遍；加显色液进行免疫组织化学显色，在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲3遍，加PBS终止反应；梯度酒精脱水之后，封片，在显微镜下进行观察、拍照。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 肿瘤生长曲线

用卡尺测定肿瘤体积，结果如图1所示，与CON和GFP组相比，Survivin-shRNA组裸鼠体内肿瘤生长速度较缓慢，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 裸鼠骨肉瘤生长曲线

2.2 Western blot结果显示各组裸鼠蛋白表达水平

Western blot结果发现，与CON和GFP组相比，Survivin-shRNA组中LC3、P62蛋白表达水平升高，mTOR蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，如图2所示。

图2 Western blot分析各组蛋白表达水平

2.3 免疫组织化学结果显示各组裸鼠蛋白表达水平

免疫组织化学结果显示，LC3与P62表达在治疗组中明显高于对照组，而mTOR表达相反，经检验差异有统计学意义(P<0.05)。如图3所示。

图3 免疫组织化学结果显示各组蛋白表达水平

3 讨论

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，病变来源于间充质细胞，多发于四肢长骨干骺端，以股骨远端最常见，以纺锤形的恶性肿瘤细胞形成不成熟的骨质为特点[4]。近年来骨肉瘤发病率持续上升，转移率和病死率很高，治疗方法主要包括传统手术切除、新辅助化疗和放疗，但患者预后未见明显改善，治疗效果往往不满意[5]。在骨肉瘤患者中，1/5因初诊时已远处转移，治疗失败和死亡[6]。近年来，基因干扰技术发展越来越成熟，大量研究表明，基因干扰可通过阻断Survivin表达来抑制肿瘤细胞[7]。基因治疗与传统药物相比，特异性强，效果较好，人体反应较轻。国内外学者对于Survivin基因与恶性肿瘤关系进行了深入研究，我们前面的实验也发现，Survivin在骨肉瘤中特异高表达，因此Survivin靶向治疗的尝试将很有前途[8]。

骨肉瘤严重影响青少年的身体健康和生命安全，因此建立准确的、具有骨肉瘤特性的动物模型至关重要。本实验采用皮下异种移植法，从整个实验的过程和结果来看，该方法造模成功率较高，值得推广应用。本实验通过卡尺测定并通过公式计算肿瘤体积，并且绘制了肿瘤生长曲线，结果显示，Survivin-shRNA组的肿瘤体积增加的幅度明显较对照组小，这表明Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤的生长。

细胞通过自身溶酶体清除受损的细胞器以及功能异常的蛋白质的过程，我们称之为细胞自噬。就本质而言，自噬是一种保护机制，平时可使体内细胞免受损伤。然而，过度的自噬效应则会带来细胞死亡的风险[9]。自噬相关蛋白中，LC3相当重要，可分为Ⅰ型和Ⅱ型，LC Ⅰ存在于胞质中，LC3Ⅱ存在于自噬体膜上，参与自噬机制[10]。本研究Western Blot法和免疫组织化学法结果均发现，与CON和GFP组相比，Survivin-shRNA组中LC3、P62蛋白表达水平升高，mTOR蛋白表达水平降低，表明Survivin基因沉默后，裸鼠骨肉瘤细胞自噬活性上升，这有利于杀灭肿瘤细胞。

综上所述，Survivin-shRNA可抑制骨肉瘤细胞增殖能力，其机制可能是与调节自噬相关蛋白LC3、P62与mTOR的表达有关。