氨肽酶产生菌筛选及其对乳肽发酵脱苦的研究

陈国恒，李静，邓毛程，谭才邓，叶茂，吴林杰，李美玲，谢拥葵

1(新疆天牛乳业有限公司，新疆 伊犁，835700)2(广东轻工职业技术学院 食品与生物技术学院，广东 广州，510300)

肽是含有2个至几十个氨基酸残基的特定蛋白质片段，其中，肽链上含有10个及以上氨基酸的肽称为多肽，含有2～9个氨基酸的肽称为寡肽，含有2～4个氨基酸的肽又称为小分子肽[1]。20世纪80年代初，GARDNER等研究人员证明了寡肽不需被分解为游离氨基酸，而可以直接被机体吸收，在被消化吸收方面具有蛋白质无法比拟的优点[2-3]。肽链通常因氨基酸组成及排列方式不同，会表现出不同的生理调节功能[4]。乳蛋白重要功能是提供氨基酸和氮，是膳食蛋白质的重要组成部分，促进多种重要营养物质的吸收，如微量元素和维生素。此外研究表明，乳源蛋白质经降解，可释放出具有血管紧张素转换酶抑制活性、抗氧化活性、抗菌活性、免疫调节活性和阿片样活性的肽类物质，例如，由牛乳αs1酪蛋白中的23～34、23～27、194～199氨基酸残基和β酪蛋白的177～183氨基酸残基组成的4个寡肽具有抗高血压活性，由牛乳β酪蛋白的60～64氨基酸残基组成的β-酪啡肽5具有很强的阿片样活性，可发挥镇静、镇痛、刺激胰岛素和生长激素释放、免疫调节等功能[5-9]。近年来，乳源蛋白肽的研究及应用是食品领域的热点。但是，乳源蛋白质经水解，一些水解产物末端暴露了疏水性氨基酸残基，与味蕾上的受体蛋白接触会产生苦味[10]，从而限制乳源蛋白肽在食品领域的应用。

酸奶可以满足乳糖不耐症人群对乳制品的需求，提供丰富的蛋白质和钙，在发酵过程中产生的一些生理活性物质可以抑制有害微生物的增殖，维持肠道菌群平衡，对慢性疾病有一定功效，但不易于保藏，酸奶粉具有保质期长、便于储存等优点，已形成了商品化生产[11-12]。但是，由于寡肽苦味困扰，市场上尚未有富含寡肽的酸奶粉。本文筛选高产氨肽酶的乳酸菌，并利用该菌种对乳源蛋白肽进行脱苦研究，以期为解决富含寡肽酸奶粉的苦味问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

自然发酵马奶、脱脂牛乳，新疆天牛乳业有限公司提供。DNA提取试剂盒、16S rDNA的扩增引物以及PCR扩增试剂，其中细菌通用引物27F/1492R，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，购于深圳华大基因科技服务公司。葡萄糖、酪蛋白胨、酵母粉、脱脂奶粉、NaCl、琼脂、HCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、L-亮氨酸对硝基苯胺，市售。

1.2 主要仪器

SW-11厌氧培养箱，上海胜卫电子科技有限公司；S-300扫描电镜，日本日立公司；A200型PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；酶解罐、种子罐、发酵罐，新疆天牛乳业有限公司；H1850R高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；752 N型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；LNG-UF-101超滤膜分离装置，上海朗极膜分离设备工程有限公司。

1.3 平板分离

平板分离培养基(g/L)：乳糖10，酪蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，琼脂18，调节pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。用无菌生理盐水对自然发酵马奶进行梯度稀释，涂布于平板分离培养基上，37 ℃厌氧培养72 h，挑取周围有透明圈的菌落。

1.4 氨肽酶产生菌筛选

种子培养基(g/L)：乳糖40，脱脂奶粉5，酪蛋白胨20，酵母粉5，调节pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。发酵培养基同种子培养基。将上述挑取菌落的斜面菌种分别接入10 mL种子培养基，于37 ℃厌氧培养8 h，再分别接入200 mL发酵培养基，于37 ℃厌氧培养16 h。然后，测定发酵液中氨肽酶活力，优选产酶能力最强的菌株。

1.5 氨肽酶产生菌鉴定

利用普通光学显微镜和扫描电镜观察菌体形态。按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)的方法[13-14]，对菌种的生理生化特性进行分析。参照文献[15]的分子生物学鉴定方法，对菌种进行16S rDNA测序。将序列在NCBI中进行同源性检索，利用MEGA7.0软件以Neighbor-joining法构建系统发育树。

1.6 发酵产酶条件的优化

用20 kDa超滤膜浓缩脱脂牛乳至一半体积，按蛋白质含量加入5 000 U/g风味蛋白酶，于55 ℃下进行酶解3 h，升温至90 ℃灭酶。将5 L牛乳酶解液放入锥形瓶，于105 ℃灭菌10 min，冷却后，接入氨肽酶产生菌的斜面菌种，于37 ℃下培养8 h，作为发酵种子液。将100 L牛乳酶解液放入发酵罐，于105 ℃灭菌10 min，冷却后，接入上述种子液，分别在不同温度下和不同初始pH的条件下进行氨肽酶发酵，优选最佳的发酵产酶条件。

1.7 发酵脱苦时间的优化

在最佳温度和初始pH条件下进行发酵，从发酵9 h开始，每隔3 h取样评价苦味强度，优选最佳的脱苦时间。

1.8 氨肽酶测定方法

采用LNA法测定粗酶液的酶活力[16]。测定前，配制一系列对硝基苯胺的标准溶液，在405 nm下测定吸光度，绘制标准曲线。将发酵液于8 000 r/min、4 ℃的条件下离心15 min，收集上清液，即为粗酶液。在具塞试管中，依次加入Tris-HC1缓冲溶液、L-亮氨酸对硝基苯胺和粗酶液，在40 ℃水浴反应10 min，用30%乙酸终止反应，在405 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算酶活力。酶活力定义：在40 ℃的条件下，1 min分解L-亮氨酸对硝基苯胺产生1 nmol对硝基苯胺所需的酶量即为1个酶活力单位。

1.9 苦味强度评价方法

将不同发酵时间的发酵液与等体积纯净水混匀，用360 Da超滤膜进行浓缩至一半体积，收集浓缩液，用于苦味强度评价。参照文献[17]的苦味评价方法，以0.5×10-2、0.5×10-3、0.5×10-4、0.5×10-5、0.5×10-6g/L的硫酸奎宁溶液为苦味强度参照物，分别对应5个苦味强度级别：强、较强、中、弱、无，由11名人员组成的小组进行感官评价。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

从分离平板上挑取126个周边有透明圈的菌落，经过氨肽酶发酵筛选，发酵16 h的氨肽酶活力分布于302～1 962 U/mL。发酵液中氨肽酶活力最强的10个菌株产酶情况如图1所示，其中，菌种KM-022发酵液的酶活力最高，与有关文献报道的德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌等乳酸菌相比[18-19]，属于产酶能力较强的氨肽酶产生菌，故优选为进一步实验的研究菌种。

图1 十株菌发酵液中的酶活力Fig.1 Enzyme actiity in fermentation broth of 10 strains

2.2 菌种鉴定

经革兰氏染色与显微镜观察，菌种KM-022的菌体形态呈球形，是革兰氏阳性菌。在扫描电镜下观察，菌体的呈现形式主要是2个卵圆形菌体连成的长链，长度约为1.0～1.4 μm(图2)。

图2 菌种KM-022的电子显微镜扫描结果Fig.2 Scanning electron microscope result of strain KM-022

菌种KM-022的生理生化试验结果如表1所示，该菌种具有耐热性能，能够在15～45 ℃生长，其明胶液化试验为阳性，表明能够产生蛋白酶。

表1 菌种KM-022生理生化试验结果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain KM-022

经测序，16S rDNA序列为1 539 bp，在NCBI中Blast比较后，发现该菌种与嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的许多菌种序列同源性达到99%以上，采用MEGA10的Neighbor-joining法构建系统发育树，如图3所示。

图3 菌种KM-022的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain KM-022

菌种KM-022与菌株StreptococcusthermophilusA7033(登录号：MN447108.1)遗传距离最近，结合形态观察和生理生化试验，菌种KM-022被鉴定为嗜热链球菌(S.thermophilus)。研究表明，嗜热链球菌可产生包括氨肽酶T、氨肽酶N、氨肽酶C、Xaa-Pro氨肽酶、三肽氨肽酶、谷酰基氨肽酶、蛋氨酸氨肽酶等氨肽酶[20]，已有多个氨肽酶基因被克隆和研究，包括pepN、pepC、pepS等基因序列，通过转录组和蛋白质组学方法研究，表明嗜热链球菌生长后期上调表达的蛋白质有肽类与氨基酸运载体及特定氨基酸合成[21-22]，这与菌种KM-022具有氨肽酶产生能力的性质是一致的。

2.3 温度对产酶的影响

在初始pH 7.0和不同温度下，嗜热链球菌KM-022产氨肽酶的结果如图4所示。分别在37、40、43 ℃的条件下进行发酵，发酵液中酶活力最大值均出现在18 h，分别为2 097、2 416、2 203 U/mL，随后呈下降趋势。在40 ℃下发酵的酶活力最高，故嗜热链球菌KM-022氨肽酶发酵最适温度优选为40 ℃。其最适产酶温度与该菌种以及文献报道的其他菌株的最适生长温度是一致的[23-24]，表明该菌种在生长和发酵过程中均有较好的耐热性能。

图4 温度对产酶的影响Fig.4 Influence of temperature on enzyme production

2.4 初始pH对产酶的影响

在不同初始pH和40 ℃下，嗜热链球菌KM-022产氨肽酶的结果如图5所示。分别在初始pH 6.5、7.0、7.5下进行发酵，发酵液中酶活力最大值分别出现在18、18、21 h，分别为2 135、2 416、2 197 U/mL，随后呈下降趋势。在初始pH 7.0下发酵的酶活力最高，故嗜热链球菌KM-022氨肽酶发酵最适初始pH优选为7.0。

图5 初始pH对产酶的影响Fig.5 Effect of initial pH on enzyme production

2.5 时间对短肽脱苦的影响

在初始pH 7.0和40 ℃下，嗜热链球菌KM-022发酵脱苦的结果如表2所示。在产酶以后，产酶和酶解作用是同步的，随着发酵产酶和氨肽酶酶解作用的进行，发酵液的苦味强度逐渐减弱，发酵21 h的苦味基本消失。该条件下发酵液最高酶活力出现在18 h，脱苦效果仅延迟3 h，表明该菌种对牛乳酶解液的发酵脱苦效果良好。

表2 发酵浓缩液的苦味强度变化Table 2 Bitterness intensity of concentrated fermented liquid

3 结论

从自然发酵马奶中分离得到126株氨肽酶产生菌株，经产酶发酵筛选，确定菌种KM-022产酶能力最强。经菌体形态观察、生理生化试验和16S rDNA分子鉴定，菌种KM-022被鉴定为嗜热链球菌，属于我国可用于食品的微生物菌种。利用脱脂牛乳的酶解液为基质进行氨肽酶发酵，产酶的最佳温度和初始pH分别为40 ℃和7.0。在最佳温度和初始pH的条件下，嗜热链球菌KM-022发酵18 h的氨肽酶酶活力达到最大值2 416 U/mL，发酵21 h苦味基本消失。该菌种对乳肽的发酵脱苦效果明显，具有生产应用潜力。