利用重组酶高效转化制备稀有人参皂苷C-Mc1和C-Mc

关猛猛，刘春莹，鱼红闪*

1(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连，116034)2(大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连，116622)

人参植物的主要活性成分是人参皂苷，在人参植物中已发现了超过150种的人参皂苷[1-2]。人参皂苷Rc是人参植物中主要皂苷之一，在人参和西洋参中的含量丰富，其中人参和西洋参根总皂苷中的Rc质量分数达12%～17%，茎叶总皂苷中Rc质量分数达5%～9%[3-4]。人参皂苷Rc具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节血脂、预防糖尿病和保护神经系统的药理功能[5-6]，但其人体吸收率低，生理活性弱[7-8]。研究表明，人参皂苷生理活性与人参皂苷分子糖基数量有关，皂苷糖基数量越少其皂苷人体吸收率越高，生物利用度和药理活性越高[8-12]。人参皂苷Rc分子有3-O-β-D-Glc-(1-2)-β-D-Glc和20-O-α-L-Araf-(1-6)-β-D-Glc等4个糖基，因此，Rc药理活性低于3个糖基的稀有皂苷C-Mc1及2个糖基的稀有皂苷C-Mc[8,13]。而人参皂苷C-Mc和C-Mc1在人参、西洋参等人参植物中几乎不存在[4,13]，因此将人参中含量高的Rc皂苷转化为稀有皂苷C-Mc1和C-Mc，将会大大提高Rc的生物利用度，对人参类制品和药物的开发具有重要意义。

为了得到稀有人参皂苷C-Mc1和C-Mc，UPADHYAYA等[14]从Armillariamellea菌丝中分离筛选出能水解β-葡萄糖苷的酶，该酶分子质量为121.5 kDa，能将人参皂苷Rc转化为C-Mc和C-Mc1，但大量制备的可行性有待于进一步研究验证。课题组曾用Aspegillusnigerg.848发酵得到人参皂苷酶I型并利用该酶将一些二醇类人参皂转化为稀有皂苷C-Mc、C-Y、F2和C-K[15-16]，但其产物分离工序复杂且没有制备C-Mc1。TEN等[17]利用Sphingopyxissp.BG97转化制备了稀有皂苷C-Mc1，但没有制备C-Mc。本课题组在前期的研究中，筛选到Terrabacterginsenosidimutans菌能产人参皂苷酶，调取到该酶基因，转化至Escherichiacoli上，表达得到人参皂苷酶。进一步的研究表明，该酶能水解Rb1和Rb2等人参二醇皂苷的3-O-葡萄糖基，生成Gyp17、Gyp75、C-O和C-Y等稀有皂苷[18-19]。本文主要研究了基因工程菌产人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶的性质，系统研究了该酶水解人参皂苷Rc的3-O-β-D-葡萄糖基催化特性，建立了酶转化制备C-Mc1和C-Mc的方法，以期为今后人参成分的保健食品、化妆品和人参药物开发，提供新原料稀有人参皂苷，也为其产业化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人参皂苷标准品C-K、Rc、Rh2、C-Mc1和C-Mc，成都乐科技有限公司；薄层色谱硅胶板，杭州禾慧化工有限公司；克隆用试剂盒EzCloning Kit和pGEX 4T-1(GST基因融合载体)，韩国Enzynomics公司。

Waters 2695色谱仪，美国Waters公司；Unitary C18柱(5 μm，Φ3 mm×250 mm)，华谱新创科技有限公司；蛋白色谱柱TOSOH TSK-Gel-2000 SW(Φ7.8 mm×300 mm)，日本TOSOH生物科学公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶的制备与纯化

将T.ginsenosidimutans(Gsoil 308 2T)的人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶DNA片段(bgpA，1 947 bp)，利用EzCloning Kit试剂盒，插入于pGEX 4T-1(GST基因融合载体)，形成GST-bgpA融合基因，再转入E.coliC41(DE3)细胞表达，其细胞在LB-氨苄青霉素培养基中40 ℃培养到OD600=0.6时加入0.5 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达(20 ℃，12 h)。冷冻离心收集细胞，用磷酸钠缓冲液(含5 mmol/L的EDTA和体积分数1%的Triton X-100)洗涤后将细胞悬浮于0.05 mol/L的pH 7.0磷酸钠缓冲液中，用超声波破碎法破碎细胞，离心除去不溶物。上清液经谷胱甘肽-Sepharose 4B柱分离得到了带有GST标签的融合蛋白，用凝血酶处理切割GST标签，得到以包涵体形式表达的目的蛋白(原体冻干粉)。

将上述克隆表达的目的蛋白冻干粉200 mg与尿素14.4 g， 10 μL巯基乙醇和30 mL磷酸缓冲液(pH 7.0，0.02 mol/L)混合，常温下轻微摇晃2 h使包涵体被充分溶解，再加入1.2 L磷酸缓冲液(含有体积分数5%的甘油、0.5 g/L聚乙二醇、体积分数0.003 7%巯基乙醇、0.1 g/L NaCl)混合均匀，待恢复酶蛋白空间结构后即为粗酶液，4 ℃保存待用。

上述粗酶液经通过Capto Q阴离子交换层析[20]分离纯化，得到人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶。通过HPLC和SDS-PAGE法检测确定其为纯酶，酶的分子质量测定以标准蛋白的分子质量为依据，SDS-PAGE法测定。

人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶对人参皂苷Rc的催化反应：将0.2 mL 4 g/L的人参皂苷Rc与0.2 mL的酶液混合(pH 5.0)，在40 ℃分别反应6、16、36 h，采用HPLC方法检测，计算底物和产物含量比例。酶活力定义为最适反应条件下，每小时水解1 mmol底物所需酶量为1个酶活力单位。

1.2.2 纯酶的最适pH和最适温度

取0.1 mL 4 g/L的人参皂苷Rc溶液在不同pH的磷酸缓冲液体系下与等体积纯酶反应，在40 ℃下反应6 h后经薄层色谱(thin-layer chromatography，TLC)检测，以pH为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，确定最适pH。

取0.1 mL 4 g/L的人参皂苷Rc溶液(pH 7.0)在不同温度下与等体积纯酶反应6 h，TLC检测相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，确定酶的最适温度。

1.2.3 酶反应动力学

上述人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶米氏常数Km和最大酶反应速度max测定：配制浓度为10、13.3、20、26.7、40 mmol/L的人参皂苷Rc溶液，在40 ℃分别反应0.5、1、1.5、2、2.5 h；其反应液经HPLC分析，计算底物减少初速度，建立1/S对1/曲线(Linweaer-Burk plots)[21]，得到Km和m值，其米氏方程如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 底物浓度和时间对粗酶反应的影响

用pH 7.0磷酸缓冲液配制0.2 mL的质量浓度为10、20、50、100 g/L的人参皂苷Rc溶液，与等体积粗酶液混合，使最终人参皂苷Rc质量浓度为5、10、25、50 g/L，40 ℃反应24 h。TLC检测人参皂苷Rc的转化，确定最佳底物浓度。

取0.2 mL 10 g/L的人参皂苷Rc溶液与等体积酶液在40 ℃下分别反应3、12、24、40、60 h，TLC检测人参皂苷Rc的转化，确定最佳反应时间。

1.2.5 利用粗酶制备稀有皂苷C-Mc和C-Mc1

C-Mc的制备：将8 g人参皂苷Rc在最佳条件下与粗酶反应60 h，然后在预先装好的AB-8大孔树脂柱上过柱，待皂苷都吸附在树脂后用去离子水洗去蛋白和糖类，然后用体积分数90%的乙醇将皂苷全部洗脱下来，再经D-280树脂脱色，过滤旋蒸后得到C-Mc单体皂苷。

C-Mc1的制备：在粗酶最佳转化条件下，将40 g人参皂苷Rc与粗酶反应24 h，然后经AB-8大孔树脂柱纯化和D-280树脂脱色，得到C-Mc1和C-Mc的混合品，其混合品经硅胶柱分离，得到C-Mc1和C-Mc单体产物。

硅胶柱层析：将混合皂苷用工业甲醇溶解，可加入少量氯仿促进溶解，加入样品质量2.5倍的80～100目硅胶，不断搅拌蒸干，碾碎后即为样品胶。将15倍样品质量的300～400目分离胶均匀装在柱内压实，下端用脱脂棉塞紧。样品胶均匀铺在分离胶上，并用3层脱脂棉覆盖压实，然后用氯仿-甲醇洗脱液洗脱，柱的下端放置100 mL三角瓶接取洗脱液，每瓶洗脱液都经TLC检测确定其中皂苷种类。

1.2.6 检测方法

TLC检测：根据点样的数量裁剪合适尺寸的硅胶板，距离板底部0.7 cm出作点样线，样品间距3 cm，用毛细管吸取样品进行点样，然后放入展开剂中，待展开剂到距顶部3 cm时放入显色剂中，硅胶板完全浸湿用热吹风吹干。展开剂为(正丁醇)∶(乙酸乙酯)∶(水)=4∶1∶2。显色剂为体积分数10%的硫酸，在100 ℃下显色。用Bandscan 5.0软件对TLC板上点的面积、颜色深浅进行分析。

人参皂苷的HPLC检测：2 mg样品溶于1 mL色谱甲醇待检测，流动相：乙腈(A)-水(B)：0～20 min，20% A；20～31 min，20%～32% A；31～40 min，32%～43% A；40～70 min，43%～100% A。进样量10 μL，柱温35 ℃，体积比流速0.6 mL/min，检测波长203 nm。

酶蛋白的HPLC检测：流动相为含有0.5 g/L的NaN3的0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.7)，进样量20 μL，柱温35 ℃，体积比流速1.0 mL/min。

2 结果与分析

2.1 酶的纯化结果及其催化特性

酶的纯化结果如图1所示，纯化后的酶在HPLC检测中是单峰(图1-a)；在SDS-PAGE中为单带(图1-b)，即可判断纯化后的酶为单一蛋白。依据标准蛋白的分子质量，通过SDS-PAGE所计算出酶蛋白的分子质量为72.4 kDa，与T.ginsenosidimutans菌的人参皂苷酶基因序列(bgpA，1 947 bp)翻译后的氨基酸序列分子质量(理论值)基本相符。

a-HPLC图；b-SDS-PAGE图[1-目的蛋白， 2-标准蛋白：磷酸酶b(97.2 kDa)，牛血清蛋白(66.4 kDa)、 卵清蛋白(44.3 kDa)、碳酸苷酶(29.0 kDa)、胰蛋白酶 抑制剂(20.1 kDa)和溶菌酶(14.3 kDa)]图1 纯酶的HPLC和SDS-PAGE图Fig.1 Purified recombinant enzyme in HPLC and SDS-PAGE analysis

为了解人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶对Rc的催化特性，对人参皂苷Rc不同酶反应时间的反应产物进行HPLC分析，结果如图2-a所示。酶反应6 h，50%以上的人参皂苷Rc反应生成C-Mc1；反应16 h，大部分人参皂苷Rc反应生成C-Mc1和少量C-Mc；当反应36 h，人参皂苷Rc全部反应生成C-Mc1和C-Mc。如图2-b所示，该异源表达的人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖酶催化人参皂苷Rc的过程为：先水解人参皂苷Rc的3-O-β-D-葡萄糖基生成C-Mc1，再水解C-Mc1的3-O-β-D-葡萄糖基生成C-Mc。

a-不同酶反应时间人参皂苷Rc的酶解产物的HPLC图； b-人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖酶水解Rc的反应式图2 人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖酶水解Rc的反应Fig.2 Ginsenoside Rc hydrolysis by recombinant ginsenoside-3-O-β-D-glucosidase 注：A-酶反应6 h的产物；B-酶反应16 h的产物； C-酶反应36 h的产物

2.2 纯酶的最适pH和最适温度

2 g/L的人参皂苷Rc在不同pH磷酸缓冲液反应体系下与纯酶反应6 h，其酶活力如图3所示，人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶反应的最适pH为7.0。

图3 不同pH对人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖 酶活力的影响Fig.3 Effect of different pH on ginsenoside-3-O- β-D-glucosidase actiity

2 g/L的人参皂苷Rc在pH 7.0条件下，在不同温度中与纯酶反应6 h。其酶活力检测结果如图4所示，酶反应的最适温度为40 ℃。

图4 不同温度对人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖 酶活力的影响Fig.4 Effect of different temperature on ginsenoside- 3-O-β-D-glucosidase actiity

综上可知，人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶水解Rc最适pH为7.0，最适温度为40 ℃。

2.3 酶反应动力学

人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶米氏常数Km和最大酶反应速度max测定：底物浓度[S]为10、13.3、20、26.7、40 mmol/L人参皂苷Rc，在40 ℃分别进行酶反应0.5、1、1.5、2、2.5 h；经HPLC分析，计算底物减少的初速度，建立1/S对1/值(表1)的曲线(Linweaer-Burk plots)，如图5所示，得到Km值为6.25 mmol/L，m值为19.6 mmol/(h·L)。根据米氏方程：人参皂苷Rc浓度为5 mmol/L时酶反应速度为=8.67 mmol/(h·L)。

表1 不同底物浓度的酶促反应初速度Table 1 The initial reaction rate of pure enzyme with Rc at different substrate concentrations

图5 人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶的双倒数图Fig.5 Linweaer-Burk plot of combinant ginsenoside- 3-O-β-D-glucosidase

2.4 底物浓度和时间对粗酶反应的影响

由于酶的纯化成本高，如下用粗酶转化制备C-Mc和C-Mc1。通过1.2.1中的方法制得了粗酶液，为了解粗酶的反应条件，探讨了pH和温度对粗酶反应的影响，其结果与纯酶相同。

进一步探讨了粗酶制备C-Mc1的最佳底物浓度，如图6所示。5 g/L的Rc皂苷酶反应24 h，人参皂苷Rc完全反应，产物主要为C-Mc1和C-Mc；10和25 g/L的Rc皂苷酶反应24 h，人参皂苷Rc几乎全部转化为C-Mc1；50 g/L的Rc皂苷酶反应24 h，只有部分Rc皂苷转化为C-Mc1。因此，要从Rc皂苷制备C-Mc1，需酶反应体系中人参皂苷Rc质量浓度为10～25 g/L；要制备C-Mc皂苷，需酶反应体系中人参皂苷Rc质量浓度为5 g/L。

a,b,c,d,e分别为Rc、C-Mc1、C-Mc、C-K、Rh2人参皂苷标准品； 1～4分别为底物质量浓度5、10、25、50 g/L图6 不同Rc底物质量浓度对粗酶反应的影响TLC图Fig.6 Effect of Rc concentration on crude enzyme reaction by TLC

反应时间对粗酶反应的影响如图7所示，5 g/L的Rc酶反应3 h和12 h，部分人参皂苷Rc被反应生成C-Mc1；反应24 h，人参皂苷Rc几乎全部反应，生成大量C-Mc1和少量的C-Mc；反应40 h，主要产物为C-Mc1和C-Mc；反应60 h，Rc全部反应生成C-Mc。

a,b,c,d,e分别为Rc、C-Mc1、C-Mc、C-K、Rh2人参皂苷标准品； 1～5分别为反应时间3、12、24、40、60 h的产物图7 反应时间对Rc粗酶反应的影响TLC图Fig.7 Reaction time effect on ginsenoside Rc crude enzyme reaction by TLC

综上可知，利用粗酶转化人参皂苷Rc制备C-Mc1，需10～25 g/L的Rc在40 ℃下反应24 h；制备C-Mc，需5 g/L的Rc在40 ℃下反应60 h。

2.5 利用粗酶制备稀有皂苷C-Mc和C-Mc1

C-Mc的制备：将8 g的Rc皂苷(7.4 mmol)配制成800 mL质量浓度为10 g/L的人参皂苷Rc溶液，再与等体积粗酶液混合(最终人参皂苷Rc质量浓度为5 g/L)，在40 ℃下反应60 h，吸附、洗脱并脱色后，最后将乙醇洗脱液过滤，旋蒸得到5.2 g(6.9 mmol)的C-Mc单体，经HPLC检测，其纯度达到90%以上(图8)，C-Mc的摩尔得率高达93.2%。

C-Mc1的制备：将40 g底物Rc(37.1 mmol)配制成1 L的人参皂苷Rc溶液，与等体积粗酶液在40 ℃条件下搅拌反应24 h(人参皂苷Rc终浓度为20 g/L)，吸附、洗脱并脱色后，过滤旋蒸得到30 g的C-Mc和C-Mc1混合品。将混合品用甲醇溶解，再与80～100目硅胶混合搅拌，蒸干后均匀铺在预先装好的分离胶上方，用纯氯仿通柱，然后用(氯仿)∶(甲醇)=8.5∶1.5的洗脱液洗脱，分别收集合并C-Mc1和C-Mc的洗脱液，过滤旋蒸后得到25.5 g的C-Mc1(27.8 mmol)和3.1 g的C-Mc(4.1 mmol)单体，经HPLC检测，其纯度都在90%以上(图8)，C-Mc1的摩尔得率为74.9%，C-Mc的摩尔得率为11.1%。

图8 粗酶转化Rc制备的稀有人参皂苷C-Mc1和 C-Mc单体HPLC图Fig.8 The HPLC of ginsenoside C-Mc1 and C-Mc from Rc by crude enzyme reaction

3 结论与讨论

利用E.coli细胞异源表达了来自T.ginsenosidimutans菌的人参皂苷3-O-β-D-葡萄糖苷酶，经测定酶分子质量为72.4 kDa，确定了酶最适反应pH为7.0，最适反应温度40 ℃，Km值为6.25 mmol/L，m值为19.6 mmoL/(h·L)。该酶能水解人参中含量较高的人参皂苷Rc的末端3-O-β-D-葡萄糖基，生成稀有皂苷C-Mc1, 进一步水解C-Mc1的3-O-β-D-葡萄糖基生成稀有皂苷C-Mc。

利用基因工程菌制取的粗酶，转化Rc皂苷制备C-Mc1和C-Mc中，20 g/L的Rc粗酶反应24 h，C-Mc1摩尔得率达74.9%，C-Mc摩尔得率为11.1%，并经硅胶柱分离可得C-Mc1和C-Mc单体皂苷；5 g/L的Rc粗酶反应60 h，C-Mc的摩尔得率高达93.2%，文中所述的酶转化Rc皂苷制备C-Mc1和C-Mc的方法，为今后高活性稀有人参皂苷C-Mc1和C-Mc的产业化提供依据。