HPLC-MS/MS法同时测定难治性癫痫患者血浆中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平的浓度

李超 王建欣 朱秀芳

难治性癫痫约占癫痫病例的10%，具有治疗困难，病情易反复等特点[1]。治疗仍以药物治疗为主，托吡酯、左乙拉西坦(LEV)与卡马西平(CBZ)的联合治疗显示出明显的疗效，减少了癫痫发作频率并具有良好的安全性，通常是难治性癫痫一个有用的临床选择[2]。然而，这些抗癫痫药物的使用具有患者个体差异大、安全性低和毒性高等特点。因此，监测药物的血药浓度是临床实践中调整剂量、减少不良反应和确保疗效的一个重要指示。本研究在现有研究的基础上[3-14]，建立了一种基于HPLC-MS/MS的方法，用于快速、准确地测定难治性癫痫患者中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平的浓度。

1 材料与方法

1.1 仪器 美国AB SCIEX公司电喷雾离子源(ESI源)4000Q TRAP型质谱仪)；含液相输液泵、自动进样器和日本日本岛津公司的HPLC-30A液相色谱系统；美国SCILOGEX公司D3024型台式高速微量离心机。

1.2 实验药品与试剂 托吡酯、左乙拉西坦及卡马西平对照品，均由成都德斯特生物技术有限公司提供，含量均≥98%，批号分别为：DST181230-023、DST190223-028和DST190228-318；；内标咖啡因内标，购自中国食品药品检定研究院，含量：99.9%，批号：171215-2010。空白血浆取自河北医科大学第一医院。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：色谱柱为Phenomenex Kinetex XB-C18，(2.6 μm，50×3 mm)；流动相为甲醇(A)-水(含2%的甲酸)(B)，按照以下梯度进行洗脱(0～2 min，30∶70→80∶20；2～4 min，80∶20；4～5 min，80∶20→30∶70)；流速为0.4 ml/min；柱温为40℃；进样量为5 μl。

1.3.2 质谱条件：ESI源，正离子模式进行检测，MRM模式进行扫描；ESI源电压为5 500 V，ESI源温度为 600℃；气帘气压力为20 psi，辅助气压力为55 psi，雾化气压力为55 psi，碰撞气压力为High；毛细管入口和出口的电压都为10 V。见表1。

表1 托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平和咖啡因的质谱碎片及参数

1.3.3 对照品和内标溶液配制

1.3.3.1 对照品溶液配制：精密称定托吡酯对照品5.00 mg，用甲醇定容为1 mg/ml的托吡酯储备液。甲醇稀释该托吡酯储备液成浓度分别为5、50、150 μg/ml的托吡酯系列质控样品以及浓度分别为1、5、10、50、100、150、200 μg/ml的托吡酯系列标准曲线溶液；以上述同法配置浓度分别为50、200、500 μg/ml和浓度分别为0、50、100、200、300、500、700 μg/ml的左乙拉西坦系列质控样品和系列标准曲线溶液；浓度为5、50、150 μg/ml和浓度分别为1、5、10、50、100、150、200 μg/ml的卡马西平系列质控样品和标准曲线溶液。

1.3.3.2 内标溶液配制：精密称定咖啡因对照品1.00 mg，用甲醇将对照品定容为1 mg/ml的咖啡因内标储备液。后用甲醇将其稀释成1 μg/ml的咖啡因内标溶液。

1.3.4 血浆样品处理：在100 μl空白血浆中加入10 μl 内标溶液及30 μl甲醇，涡旋混匀30 s后，加入260 μl甲醇，再涡旋混匀60 s，以12 000 r/min于室温下离心10 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液取5 μl进样分析。

1.3.5 方法学考察

1.3.5.1 专属性：以给药60 min后患者血浆、对照标准品+空白血浆和空白血浆的各6个样品分别进样，测定各样品的色谱图。

1.3.5.2 标准曲线及定量下限：在100 μl空白血浆中分别加入10 μl不同浓度的托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平系列标准曲线以及内标溶液，配成浓度为0.1、0.5、1、5、10、15、20 μg/ml的托吡酯系列血浆样品，1、5、10、20、30、50、70 μg/ml的左乙拉西坦系列血浆样品， 0.1、0.5、1、5、10、15、20 μg/ml的卡马西平系列血浆样品，以1/χ2为权重，将y/x进行进行回归分析，其中y=待测物峰面积/内标峰面积，x为待测物的浓度。

1.3.5.3 准确度及精密度：于100 μl空白血浆中，分别加入10 μl不同浓度的托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平系列质控样品溶液以及内标溶液质控样品溶液，配成浓度为0.5、5、15 μg/ml托吡酯，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，0.5、5、15 μg/ml卡马西平的系列血浆质控样品溶液各6份，连续3 d进行测定，并计算其准确度、日内精密度和日间精密度。

1.3.5.4 提取回收率及基质效应：取不同浓度分别为0.5、5、15 μg/ml的托吡酯，浓度为5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，浓度为0.5、5、15 μg/ml卡马西平的血浆质控样品溶液各6份，得峰面积A；另取100 μl 的空白血浆18份，均加入260 μl甲醇，涡旋混匀60 s， 12 000 r/min室温下离心10 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，将相应浓度的托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平和咖啡因溶液加入续滤液中，涡旋60 s后进样分析，得峰面积B。提取回收率=峰面积A/峰面积B。以100 μl空白血浆100 μl，得空白基质，加入10 μl不同浓度的托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平质控样品溶液以及内标溶液，配成浓度为0.5、5、15 μg/ml托吡酯基质考察样品，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦基质考察样品，0.5、5、15 μg/ml卡马西平的基质考察样品各6份，进样分析，得相应峰面积C；于纯水中加入不同浓度的托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平质控样品及内标溶液质控样品，配成浓度分别为0.5、5、15 μg/ml托吡酯质控样品，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦质控样品， 0.5、5、15 μg/ml卡马西平的质控样品各6份，得相应峰面积D。内标归一化的基质因子=峰面积C/峰面积D×100%。

1.3.5.5 稳定性：取24份血浆质控样品溶液，分别含浓度分为0.5、5、15 μg/ml托吡酯，5、20、50 μg/ml左乙拉西坦，0.5、5、15 μg/ml卡马西平，考察其在室温6 h放置、处理后3 d放置、3次反复冻融、20 d-20℃冻存的稳定性。

1.3.6 临床应用

1.3.6.1 受试者的选择：本研究方案已经过河北医科大学第一医院伦理委员会的审查和批准。纳入标准：所有纳入的患者均符合《神经外科与癫痫》中难治性癫痫的诊断标准[1]；患者正在继续接受托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平的口服治疗；左乙拉西坦维持剂量为30 mg·kg-1·d-1；托吡酯维持剂量为4 mg·kg-1·d-1；卡马西平维持剂量为15～20 mg·kg-1·d-1；已获得患者和家属的知情同意；并且未同时联用其他抗癫痫药物；排除标准：非癫痫性精神疾病的患者；孕妇和哺乳期女性；严重肝肾功能损害患者；易过敏体质者，对托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平存在禁忌证者。

1.3.6.2 受试者血样采集：这些受试者按维持剂量口服3种药物1 d以上达稳态浓度。在早晨用药前0.5 h取前外侧静脉中抽取5 ml血液，于肝素钠管中，以5 000 r/min离心10 min，取上层血浆并储存在-80℃的冰箱中以备测量。

2 结果

2.1 专属性 根据以上操作得到托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平和咖啡因的保留时间分别为2.81、0.88、3.38 和1.19。其中内源性物质不会对托吡酯、左乙拉西坦、卡马西平和咖啡因的测定结果产生影响，有良好的专属性。见图1。

图1 托吡酯(Ⅰ)、左乙拉西坦(Ⅱ)、卡马西平(Ⅲ)和咖啡因(Ⅳ)的色谱图；A 空白血浆；B 空白血浆+托吡酯+左乙拉西坦+卡马西平+内标；C 血浆样品+内标

2.2 标准曲线及定量下限 托吡酯的标准曲线方程为Y=261X152(r=0.9638)，在0.1～20 μg/ml线性范围内具有较好的线性关系，定量下限为0.01 μg/ml；左乙拉西坦的标准曲线方程为y=2.36×103x+3.57×104(r=0.9959)，在1～70 μg/ml线性范围内具有较好的线性关系，定量下限为0.1 μg/ml；卡马西平的标准曲线方程为y=2.31×104x+2.55×104(r=0.9215)，在0.1～20 μg/ml线性范围内具有较好的线性关系，定量下限为0.01 μg/ml。

2.3 准确度与精密度 3种药物的准确度均在±15%范围内，日内和日间精密度的标准偏差均在15%以下，符合生物样品定量分析的要求[15]。见表2。

表2 血浆中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平的准确度和精密度 n=6

2.4 提取和基质效应 测得在3个浓度的托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平回收率分别为为91.68%～106.45%、103.52%～107.24%和93.57%～104.31%，其内标归一化的基质因子分别为92.52%～103.87%(RSD<15%，n=6)、91.79%～104.25%(RSD<15%，n=6)和94.23%～104.48%(RSD<15%，n=6)；咖啡因回收率为92.34%，内标归一化的基质因子为98.61%(RSD<15%)。该提取物相关参数符合生物样品定量的相关要求[15]，且样品测量不受基质的影响。见表3。

表3 血浆中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平的提取回收率和基质效应 n=6

2.5 稳定性 血浆样品溶液在室温6 h放置、处理后3 d放置、3次反复冻融、20 d -20℃冻存的条件下均稳定，RSD值均小于15%。见表4。

表4 血浆中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平的稳定性 n=6

2.6 临床应用 共纳入32例难治性癫痫患者，其中男14例，女18例；年龄20～48岁，平均(34.6±7.65)岁；体重45～67 kg平均(54.0±6.02)kg；身高172～180 cm,平均(175.3±2.29)cm。经测定32例难治性癫痫患者体内托吡酯血药浓度为3.34～12.56 mg/ml，平均(7.92±1.82)μg/ml；左乙拉西坦的血药浓度为15.62～48.25 kg/ml，平均(30.34±8.13)μg/ml；卡马西平的血药浓度为3.24～15.29 mg/ml，平均(7.74±2.44)μg/ml。

3 讨论

目前测定血浆中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平浓度的方法有传统的HPLC法及HPLC-MS/MS法。传统的HPLC法灵敏度相对较低、专属性较差，而单一成分的检测方法效率不高，不适用于临床大样本的血药浓度监测。在这项研究中，开发了一种HPLC-MS/MS方法，可以同时测量血浆中3种药物的浓度，从而减少分析时间，提高分析方法的灵敏度和特异性。本研究将甲醇作为蛋白沉淀剂，在血浆样品处理上，与液-液萃取法相比，本法提取回收率较高，此外甲醇沉淀法更经济环保、便于操作。

本研究结果显示，32例难治性癫痫患者临床常规剂量给予托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平达稳态时，测得托吡酯血药浓度为3.34～12.56 μg/ml，与其临床推荐血药浓度5～20 μg/ml相比[16,17]，有2例患者低于该浓度范围；测得左乙拉西坦血药浓度为15.62～48.25 μg/ml，与其临床推荐有效血药浓度12～46 μg/ml相比[18,19]，有1例患者高于该浓度范围；测得卡马西平血药浓度为3.24～15.29 μg/ml，与其临床推荐有效血药浓度4～12 μg/ml相比[20,21]，有1例患者高于该浓度范围，1例患者低于该浓度范围。由此得出这3种药物在不同人群中血药浓度差别大，存在一定的个体差异性。临床使用时需进行TDM监测，以便制定个体化给药方案，减少不良反应的发生。

综上所述，本研究建立的同时测定血浆中托吡酯、左乙拉西坦和卡马西平浓度的HPLC-MS/MS法，适用于临床上监测难治性癫痫患者体内的血药浓度，从而用于指导患者调整给药方案，提高用药的合理性，减少不良反应的发生。