近视视网膜病变与CaMKKβ/AMPK信号通路的相关性

龙丹宁 莫亚 何希 郭传恒 马捷

近视是一种多因素疾病，其特征是平行光聚焦在视网膜前方，而不是聚焦在放松眼睛的视网膜上。在视觉通路中，视网膜是第一个检测光信号并将光信号转化为神经元信号的地方。近视视网膜病变作为近视的主要并发症之一，其对视功能有一定的危害，甚至引起失明，会带来极大的经济负担、社会压力和心理压力。目前虽然对近视视网膜致病机制通路方面的研究颇多，例如前列腺素F2α-FP受体信号通路[1]、miRNA- mRNA信号通路[2]、多巴胺受体D1信号通路[3]等，但是对于自噬在近视视网膜病变研究方面尚未见报道，CaMKKβ/AMPK信号通路作为新的研究热点及经典通路，已有研究表明二者存在相关性，且自噬和氧化应激均与视网膜病变高度相关，故本文将主要从这方面来阐述表达，旨在为近视视网膜病变提供新的研究和治疗方向。

1 近视与视网膜病变

1.1 近视总体概要 近视是全球范围内一种常见的眼病，近年来屈光不正尤其是近视的患病率在急剧上升,且呈低龄化趋势[4]。2000年全球有近14亿人近视，据估计，到2050年此数字将高达48亿，高度近视患病率占10亿，且未矫正的近视将会是全球远距离视力障碍的主要原因[5]。近视进一步发展导致的高度近视眼底病变会出现脉络膜视网膜萎缩、视网膜脱离、后巩膜葡萄肿、视网膜撕裂及视网膜变薄等并发症，可致不可逆的视力损害，甚至引起失明，且研究表明大多数不可逆的失明是由视网膜疾病引起的[6]。笔者发现目前尚不清楚近视确切的发病机制。多数研究认为近视是由环境和遗传风险因素共同引起的[7]，迄今为止发现的所有遗传位点都表明屈光发育是由许多重叠的生物学过程介导的异质过程，因此不可能由一个基因(或基因家族)单独负责视网膜萎缩或新生血管病变的发展[8]，有一些环境风险因素例如竞争性和压力性教育系统[9]，睡眠时间变短，户外活动时间减少及长时间观看电子产品等也参与近视的形成过程。已有研究表明控制近视进展可以使近视视网膜疾病的相对风险降低约3倍[10]，因此，在近视的进展过程中需要采取有效策略来延缓近视的发生发展并预防并发症的出现，以避免视功能障碍，进一步影响生活质量。

1.2 近视的视网膜病变

1.2.1 视网膜厚度：视网膜位于眼球壁的内层，为一层柔软而透明的膜，其是由色素上皮层和视网膜感觉层组成。视网膜有包含感知图像焦点的机制，可在屈光发育过程中产生调节眼睛生长的信号。屈光状态的改变将伴随眼轴长度的改变，在组织学上，眼轴的变长会导致视网膜的生物力学伸展，进而引起视网膜变薄[11]，影响视网膜细胞的供血和供氧[12]。近视程度与视网膜厚度显着相关，随着近视程度的增加，小凹旁和小凹周围区域的视网膜厚度将会迅速减小[13]，主要与赤道和赤道前区域的视网膜厚度变薄有关，中央凹区域受影响较小，水平轴和垂直轴的视网膜厚度的也是不对称的[14]。有研究表明近视儿童的中心凹旁视网膜厚度平均变薄6 μm，然而在18个月内，视网膜厚度和各层的纵向变化幅度很小(18个月内平均变化< 2 μm)，且在12岁时的颞侧视网膜厚度变薄与随后1年内的眼轴增长有强烈的相关性，在性别上男孩的眼轴长度增加较女孩多[15]。在高度近视眼中黄斑部的个体视网膜厚度与眼轴<26 mm的眼睛年龄呈负相关，主要是在内层视网膜、光感受器和总视网膜中，可能原因为衰老与视网膜神经元和神经胶质细胞损伤有关[16]。

1.2.2 视网膜氧供：视网膜是一个需氧量高、新陈代谢强、氧化还原反应活跃的组织。在生理条件下，视网膜不断受到外界光线的刺激，引起光氧化作用，促进氧自由基的形成。此外，细胞内的有效抗氧化剂，如超氧化物歧化酶是可以及时清除氧自由基的。氧气主要通过两种方式组合传递到视网膜，包括脉络膜血管床和视网膜脉管系统。视网膜作为主要的耗氧组织之一，而且还作为人体中氧化环境最明显的组织之一，在光感受器内节盘膜和内部丛状层的区域中视网膜最容易发生缺氧[17]。随着近视程度的加深，黄斑区浅表和深层视网膜血管密度降低[18]，血管的异常会改变氧气的供应，自由基超氧化物或过氧亚硝酸盐的产生会损害视网膜导致视网膜萎缩、视网膜脱离等的出现，因为眼睛血管化为视网膜提供了较高的局部氧气压力。视网膜中的氧化应激还会引起视网膜色素上皮层细胞变性和感光细胞的丢失[19]，视网膜的退行性病变又促进近视形成和发展。

1.2.3 视网膜血管：视网膜是中枢神经系统的一部分，具有大脑特有的新陈代谢，且眼部的代谢水平远远高于脑组织，视网膜的高能量需求通常与大量代谢物匹配，当视网膜血流受损时视网膜神经元有兴奋性毒性细胞死亡的风险[20]。视网膜微血管网络维持眼内环境稳态，可直接为视网膜组织提供氧气和营养，近视性血管损伤致使稳态失衡而会引起细胞变性坏死，导致近视视网膜疾病甚至丧失视功能。脉络膜作为眼睛的血管层可间接为外层视网膜提供氧气和营养。近视导致眼轴延长会机械拉伸视网膜组织，并随着轴向伸长方向使视盘倾斜，从而导致视网膜中央凹旁微血管密度减少[21]，视网膜小动脉血氧饱和度降低，中央凹无血管区面积增大，且深层视网膜血管密度减少与视网膜平均光敏感度、最佳矫正视力的降低密切相关。此外，视盘倾斜程度与乳头周及深小凹旁血管密度和中央凹无血管区面积呈正相关。同时伴随近视的进展，眼轴延长使视网膜厚度变薄会导致视网膜血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞变性，从而引起血管内皮生长因子产生和微血管密度的相应降低[22]，在高度近视眼中会出现浅表血管密度降低，视网膜外流量增加[23]，而视网膜微血管血流速度保持不变。视网膜微血管网络的改变可能归因于随着近视进展而发生的眼轴延长，对视网膜微血管系统的新定量分析可能有助于表征近视的潜在病理生理学，并能够及早发现和预防近视性视网膜病变[24]。

1.2.4 视网膜微生态:视网膜色素上皮是高度特化的单层色素细胞，在神经视网膜和血管脉络膜之间形成屏障，在维持视网膜稳态方面起着非常重要的作用。视网膜作为感光组织，可检测和处理视觉图像[25]，它是通过感测光并产生脉冲来实现此目的，然后通过视神经将其传输到大脑[26]。视网膜细胞可在屈光发育过程中产生调节眼睛生长的信号，其中散焦图像对视网膜神经节细胞的信号传导影响显著，例如可降低视神经中峰值的频率。在近视患者中发现多焦视网膜电图反应密度下降，这种改变主要是由于视网膜感受器功能受损所致[27]。线粒体功能障碍可改变有氧能量代谢，与许多视网膜疾病有关，其中包括感光细胞变性[28]。Ca2+在视杆和视锥感光细胞的功能和存活中起重要作用，因此保持适当的Ca2+稳态对光感受器的健康和生存至关重要[29]。血清 25-羟基维生素 D与近视发展及眼部炎症呈负相关趋势，维生素 D 可在Ca2+调节功能中起作用，例如抗氧化或抗炎。体内和体外的既往研究均表明，近视发生过程中视网膜色素上皮组织形态学和离子稳态发生变化，且视网膜色素上皮分泌的多巴胺、乙酰胆碱等神经递质和转化生长-β、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子等多种生长因子与近视发展过程密切相关[30]。与室内光线相比，室外阳光有更强烈的短波辐射，视网膜多巴胺水平会随着短波光的反应而增加，视网膜电路中的紫外线锥体可能是短波光保护的基础[31]。Yang等[32]研究发现近视进展与葡萄糖含量增加和脂质生物合成减少之间呈负相关，在近视进展过程中检测到大部分已知的氨基酸，发现酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸均是减少的。

2 CaMKKβ/AMPK信号通路在近视视网膜病变中的运用

2.1 CaMKKβ/AMPK信号通路 AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是由一个催化α亚基和两个调节亚基β和γ组成的异构复合物[33]，不同组合可创建12个不同的AMPK复合物。α亚基包含激酶结构域和关键残基Thr172，该残基被上游激酶磷酸化。β亚基包含碳水化合物结合模块，该模块允许AMPK与糖原结合。γ亚基使AMPK能够响应ATP与AMP比率的变化，因为它包含四个串联腺嘌呤核苷酸β-合酶结构域，并与腺嘌呤核苷酸结合。Ca2+是二级信使，在细胞信号传导中起重要作用，钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是一种较小的蛋白质[34]，CaMKKβ为CaMKK的一种亚型，是被细胞内钙水平升高激活的主要激酶。

AMPK是能量稳态的中央调节器[35]，被提议用来调节能量稳态[36]，细胞生长，自噬和线粒体生物学[37]。作为细胞能量传感器，AMPK具有两种激活模式，可以通过细胞本身或通过AMPK介导的上游酶激活[38]。上游AMPK激酶CaMKKβ可以在响应细胞Ca2+增加的情况下激活AMPK[39]，而不需要ATP/ADP/AMP水平的任何显著变化[40]，AMPK的最独特的核苷酸非依赖性调节是CAMKKβ将Thr172磷酸化[41]。

CaMKKβ/AMPK信号通路是调节细胞能量代谢的经典途径之一[42]。AMPK不仅是氧化还原信号的传感器，而且一旦被激活也起着抗氧化的作用[43]，氧化应激已被认为是导致近视发生的潜在机制[44]，近期也有研究首次提出近视、氧化应激以及生长因子3个因素可在近视患者中共存。

2.2 自噬与CaMKKβ/AMPK信号通路 自噬是一种基本的分解代谢机制，可维持细胞内稳态，最早由De Duve[45]于1963年提出在巨噬细胞自噬过程中，噬菌体的成核和膨胀导致自噬体形成，随后自噬体成熟，与溶酶体融合，产生自溶酶体[46]，它降解异常或受损的蛋白质和细胞器[47]，最终的分解产物，例如氨基酸，核苷，碳水化合物和脂肪酸，为生物合成和能量产生提供了底物，从而维持了细胞的新陈代谢[48]。自噬主要可以分为三种类型：宏观自噬，伴侣介导的自噬和微自噬。

自噬水平在生理条件下较低，但在低氧条件下可增加，这种增加可以加重伤害，但也可以起到保护作用。自噬在免疫系统中有多个角色，例如调节炎症，参与微生物的降解等[49]。活化的AMPK调节各种代谢过程，包括自噬，还可以上调线粒体的自噬降解(有丝分裂)，因为它可以诱导网络中受损的线粒体破碎，并促进自噬机制向受损的线粒体移位[50]。1993年Gordon等第一次报告了Ca2+对自噬的调节[51]，自噬与细胞内Ca2+调节相关，对细胞内或细胞外Ca2+离子的去除可抑制自噬。最近的研究证明Ca2+可通过CaMKKβ激活AMPK，进一步抑制mTOR并激活自噬，CAMKKβ抑制剂可有效阻断AMPK活性和自噬通量，从而降低细胞活力[52]。自噬的有效控制对于开发针对缺氧性损伤的新治疗策略至关重要[53]。

2.3 CaMKKβ/AMPK信号通路在近视视网膜病变中的应用 由于近视而引起的视网膜病变通常会导致视力障碍，其潜在的分子机制在很大程度上尚不清楚[54]。直到最近，研究才专注于自噬在视觉系统中的作用。自噬的经典过程可以概括为5个步骤：起始/成核，延伸，成熟，融合和降解[55]。眼睛，尤其是视网膜，暴露于各种环境损害和压力下，包括基因突变和与年龄有关的变化，这些都会导致功能障碍[56]。近视视网膜疾病中，自噬起着双重作用：促进视网膜细胞的存活和死亡。正常水平的自噬有助于视网膜细胞防御有害压力。但是，自噬过多会导致视网膜退化[57]及视网膜毛细血管周细胞死亡。在近视小鼠研究中发现视网膜神经生长因子相关受体的表达增加，其与视网膜神经细胞凋亡密切相关。同时在形觉剥夺性近视形成过程中发现视网膜色素上皮层细胞中的Ca2+浓度增高，进一步激活CaMKKβ/AMPK信号通路而诱发自噬。

线粒体的选择性自噬，称为线粒体吞噬，是重要的线粒体质量控制机制[58]，许多视网膜病变，例如糖尿病性视网膜病变中继发性视锥细胞感光细胞死亡，都与线粒体功能障碍直接或间接相关[59]，同时相关的动物实验证明在近视小鼠视网膜微血管内皮细胞中，自噬可通过CaMKKβ/AMPK信号通路在缺氧状态下被激活，从而起到对视网膜的调控作用。在近视视网膜疾病形成过程中炎性因子也参与疾病进展，例如白介素-6、肿瘤坏死因子-α、核因子kB等，CaMKKβ/AMPK可在炎性因子的刺激下被激活起到抗炎作用，多种作用协同可对近视视网膜疾病起到调控作用。

3 近视视网膜疾病分子细胞机制及信号通路探索

3.1 近视视网膜疾病的探索

3.1.1 近视的治疗现状：近视目前全球高患病率及低龄化趋势，已成为青少年的首要眼病，同时已有研究证实在近视进展过程中大多数不可逆的失明是由视网膜疾病引起的，例如引起的眼底并发症脉络膜视网膜萎缩、视网膜变薄、视网膜脱离、视网膜劈裂等，其中视网膜的内层劈裂多发生在神经纤维层和神经节细胞层，由内部牵拉引起(即玻璃体、内界膜牵引及视网膜血管微褶皱牵拉引起)，外层视网膜劈裂多发生在外丛状层和外颗粒层(主要由外部牵拉，即后巩膜葡萄肿)[60]。虽然近视引起的视觉模糊症状通过光学方式可以矫正，但近视问题不仅仅在于光学方面，还在于眼部的病理改变。目前对于近视的治疗已提出多种方法干预，例如生活方式干预、药理干预、光学策略及屈光手术治疗等多种方法，但在肯定治疗效果的前提下也出现了不可避免的并发症，例如使用不同浓度的阿托品滴眼液会引起畏光、视力模糊以及停药后近视反弹等的并发症，屈光手术会产生一过性或永久性眩光或光晕，尤其是夜间视力下降等。因此为进一步改善近视的致病及发展途径，开始从潜在分子/细胞机制探索。

3.1.2 近视视网膜疾病的分子细胞机制探索：视网膜作为眼部耗氧和易发生氧化应激组织之一，对维持眼部稳态起着至关重要的作用。视网膜任何血管异常都会改变氧气供应并可能导致暂时性缺氧。视网膜中的氧化应激会引发一系列并发症，包括色素上皮层和光感受器的功能丧失，严重影响视力，并在近视视网膜形成过程中，色素上皮层的Ca2+浓度会增高，Ca2+的增加过多会引起视网膜光感受器细胞的变性。视网膜毛细血管网络直接为视网膜组织提供氧气和营养，这可能促使视网膜更容易受到近视相关改变的影响，同时Yuan等[61]研究发现轻度眼内炎症近视性视网膜病变的发生和发展中也起重要作用。此外，在晶状体诱发近视和形式剥夺性近视治疗后，视网膜中许多基因的表达水平也发生了变化。已有动物实验研究证实在近视早期豚鼠视网膜有显著的脂质代谢异常[62]。通常，每个视网膜可以检测到 1 000 多个蛋白质点。其中 32 个在近视和未治疗的视网膜之间显示出差异表达，例如β-肌动蛋白、烯醇化酶 1、胞质苹果酸脱氢酶等[63]。视网膜连接蛋白35/36的功能调节对于近视视网膜中的视觉信号传递过程至关重要，在近视视网膜蛋白质点很多受Ca2+的影响，进一步激活CaMKKβ/AMPK信号通路引起自噬，对近视视网膜疾病起到调节作用。

3.2 近视视网膜疾病与CaMKKβ和 AMPK信号通路

3.2.1 自噬与Ca2+信号：自噬作为一种生理细胞过程，可在细胞内进行溶酶体介导的自我消化和再循环来维持稳态，例如在近视视网膜缺氧或暴露于分子等细胞压力条件下，自噬机制可被激活。自噬也可影响免疫反应的几个关键组成部分，因此在调节近视视网膜炎性反应中起着关键作用。Ca2+作为机体各项生理活动不可缺少的离子，可对自噬起到双向调节作用。在过去的十年中，Ca2+信号在自噬调节中的作用引起了很多争议。尽管各种信号信使和下游通路都参与自噬调节，但最近Ca2+已被认为是不同细胞类型中这一过程的重要参与者。自噬正常进行所需的Ca2+信号可以源自特定的细胞内来源(高尔基体、溶酶体或其他酸性囊泡等)或通过不同的Ca2+通道来自细胞外介质，如激活下游效应器，Ca2+与CaMKKβ/AMKP 信号通路相关[64]。Ca2+可(维生素 D3、毒胡萝卜素等)通过涉及 CaMKKβ和 AMPK 的信号通路抑制 MTOR 的活性，从而诱导自噬体积累。此外Ca2+信号传导也可以独立于Ca2+介导的 AMPK 激活诱导自噬[65]。Ca2+通道作为离子通道的一种，控制自噬发生的机制在于可介导离子流入/流出细胞或细胞器，控制跨细胞膜的电位差，另一个机制是可调节脂质从细胞内细胞器和质膜到吞噬细胞组装位点的转移。

3.2.2 CaMKKβ/AMPK信号通路的激活： AMPK 是关键的细胞能量传感器和代谢稳态调节器。通常AMPK 有两种激活模式，可以被细胞本身激活，也可以被 AMPK 介导的上游酶激活。在其上游蛋白质中， CaMKKβ是一种重要的上游活化酶，与细胞代谢有关。而CaMKKβ/AMPK信号通路是调节细胞能量代谢的经典通路之一。激活的AMPK上调分解代谢途径并下调合成代谢途径以促进外周组织中ATP的生成。在细胞应激期间ATP与 AMP 的比率下降，该蛋白激酶就会被激活。AMPK 激活会下调消耗能量的途径，例如蛋白质合成，同时上调产生 ATP 的途径，例如脂肪酸氧化。既往对AMPK活性基因的研究表明在 CaMKKβ 下游激活的 AMPK 存在于细胞质和细胞质中。CaMKKβ是一种重要的Ca2+通道激酶，Green等[66]研究表明CaMKKβ/AMPK 复合物存在于静息细胞的细胞质中以及在 Ca2+刺激之后，在Ca2+刺激后 AMPK 的激活首先发生在细胞质中，然后再在细胞核中激活。Ca2+可提高细胞溶质钙浓度，通过激活CaMKKβ/AMPK途径引起自噬，此外淀粉样蛋白β也通过相同的 CaMKKβ/AMPK 信号通路促进自噬囊泡的形成。可对近视的视网膜病变进行预防及治疗，同时，对近视进展过程中的氧化应激、眼部炎症、疼痛等也有一定的改善作用。

总之，近视会引起眼部相应的视网膜病变，例如视网膜变薄，视网膜萎缩等，既往研究已经证明氧化应激和自噬与近视视网膜疾病密切相关，在视网膜发育的生理过程中会消耗大量的氧气，近视导致视网膜生物力学的拉伸会进一步增加耗氧量，并且在近视形成过程中，视网膜色素上皮细胞中Ca2+浓度增高[67]，上游AMPK激酶CaMKKβ可以在响应细胞Ca2+增加的情况下激活AMPK，从而调节能量稳态、细胞生长、自噬和线粒体生物学，进一步应对近视视网膜损伤，防止近视视网膜病变。