白藜芦醇对非酒精性脂肪性肝病小鼠Notch1信号通路的影响

刘志红,刘 静,孟令振,鲁 明,王瑞英

(1. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000；2. 河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种排除乙醇和其他明确原因导致肝组织脂肪过度沉积为特征的疾病，如不有效控制，约40%的患者可进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎[1]。目前研究认为NAFLD是代谢综合征的危险因素，与2型糖尿病、肥胖和胰岛素抵抗密切相关[2]。控制饮食、减轻体重和运动虽然可以减轻或逆转NAFLD，但患者难以长时间坚持，因此，需要开发新的治疗药物和鉴定新的治疗靶点。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，在红葡萄、蓝莓、花生等多种植物中广泛存在，其具有抗炎、抗氧化应激、抗癌、抗衰老等多种作用，且被证实可有效减轻NAFLD小鼠肝脏病变程度[3-4]。Notch 基因参与调节细胞代谢过程，当Notch基因表达异常时，机体代谢发生紊乱，会引起胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱及肥胖等，从而导致包括NAFLD在内的多种疾病发生[5-6]。本实验观察了白藜芦醇对NAFLD小鼠肝脂肪变性及Notch信号通路的影响，旨在进一步明确其作用及可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠40只，体重21.0～23.0 g，购于北京维通利华公司，合格证号：SCXK (京)2016-0006。本实验符合动物保护、动物福利和伦理原则，符合国家实验动物福利伦理的相关规定。饲养在环境温度为(22±2)℃，相对湿度(55±5)%，12/12 h日/夜光照循环屏障动物房中。

1.2药品与试剂 白藜芦醇(美国Sigma公司)。总胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量预混试剂(北京天根生化科技有限公司)；兔抗鼠Notch1抗体(Abcam公司)。

1.3仪器 Multiskan FC型酶仪(美国Thermo公司)；LEICA 819切片机(上海徕卡仪器有限公司)；DYY-Ⅲ型稳流电泳仪(北京六一仪器厂)；GDS8000凝胶成像仪(美国UVP公司)；PCR仪(美国 Thermo 赛默飞世尔科技公司)。

1.4实验方法 选取10 只 C57BL/6J 雄性小鼠作为正常组，实验过程中给予普通饲料(20%蛋白质、70%碳水化合物、10%脂肪)喂养；余30只C57BL/6J 雄性小鼠给予高脂饲料(20%蛋白质、20%碳水化合物、60%脂肪)喂养12周建立NAFLD模型，经肝脏病理检查证实造模成功后随机分为3组各10只，3组实验过程中均给予高脂饲料喂养。白藜芦醇低剂量组和白藜芦醇高剂量组分别给予白藜芦醇50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)灌胃，高脂组和正常组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃6周。

1.5检测指标及方法

1.5.1血脂指标 所有小鼠干预结束后禁食12 h，2%戊巴比妥钠(45 mg/100 g)麻醉后眼眶静脉丛取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书操作步骤测定TC和TG水平。

1.5.2肝组织HE染色病理表现 取各组小鼠肝组织，在4%多聚甲醛中4 ℃固定12 h，石蜡包埋，制成5 μm厚切片，苏木精染色8 min，自来水洗涤60 min，伊红室温复染60 s，封片，显微镜下观察。

1.5.3肝组织油红染色病理表现 取各组小鼠肝组织冰冻切片，放入油红染液中，酒精洗片，苏木精染色，酒精酸化，蒸馏水冲洗，封片，显微镜下观察。

1.5.4肝脏组织中固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和过氧化物酶增殖物激活受体α(PPAR-α)mRNA表达情况 使用Trizol试剂提取总RNA，采用NanoDrop 2000检测RNA纯度和浓度。使用反转录试剂盒合成cDNA，采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系统进行扩增反应，95 ℃下30 s预变性，95 ℃下5 s，60 ℃下退火32 s，共40次循环。将β-actin作为内参对照,基因表达水平标准化使用2-ΔΔCt方法。引物序列: β-actin正向引物为5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，反向引物为5’-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；PPAR-α正向引物为5’-GAGAATCCACGAAGCCTACCTG-3’，反向引物为5’-GACCTCTGCCTCTTTGTCTTCG-3’；SREBP-1c正向引物为5’-GAAACCCGAAGTGGTGGAGAC-3’，反向引物为5’-TGGGCTTTGACCTGGCTATC-3’。

1.5.5肝脏组织中Notch1蛋白表达情况 采用Western blot法检测：肝脏组织加入蛋白裂解液匀浆，进行蛋白定量。上样后应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统电泳、转膜、脱脂奶粉封闭、洗膜，加一抗4 ℃孵育过夜，加二抗孵育2 h，曝光显影，应用Image J软件对灰度进行测量分析。

2 结 果

2.1各组小鼠血脂指标比较 高脂组小鼠血清TG、TC水平均明显高于正常组(P均<0.05)，白藜芦醇低、高剂量组小鼠血清TG、TC水平均明显低于高脂组(P均<0.05)，白藜芦醇高剂量组均明显低于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠血脂水平比较

2.2各组小鼠肝脏病理表现 HE染色显示，正常组小鼠肝细胞结构正常，肝内小叶结构清晰，肝细胞内未见明显脂滴；高脂组小鼠肝细胞结构紊乱、肿大，有坏死现象，肝细胞脂滴空泡较多；白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝细胞结构逐渐恢复，坏死细胞和脂肪空泡均较高脂组少。见图1。

图1 正常组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝脏组织HE染色表现(×200)

2.3各组小鼠肝脏油红染色表现 油红染色显示，正常组小鼠肝脏橘红色脂滴沉积很少，高脂组小鼠肝脏橘红色脂滴沉积较多，白藜芦醇低、高剂量组小鼠橘红色沉积明显少于高脂组。见图2。

图2 正常组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝脏油红染色表现(×200)

2.4各组小鼠肝脏组织中SREBP-1c、PPAR-α mRNA表达情况 与正常组比较，高脂组小鼠肝脏组织中SREBP-1c mRNA相对表达量明显增高(P<0.05)，PPAR-α mRNA相对表达量明显降低(P<0.05)；与高脂组比较，白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝脏组织中SREBP-1c mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，PPAR-α mRNA相对表达量均明显增高(P均<0.05)；白藜芦醇高剂量组小鼠肝脏组织中SREBP-1c mRNA相对表达量明显低于白藜芦醇低剂量组(P<0.05)，PPAR-α mRNA相对表达量明显高于白藜芦醇低剂量组(P<0.05)。见图3。

图3 正常组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝脏组织中SREBP-1c和PPAR-α mRNA表达情况

2.5各组小鼠肝脏组织中Notch1蛋白表达情况高脂组小鼠肝脏组织中Notch1蛋白相对表达量明显高于正常组(P<0.05)，白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝脏组织中Notch1蛋白相对表达量均明显低于高脂组(P均<0.05)，白藜芦醇高剂量组明显低于白藜芦醇低剂量组(P<0.05)。见图4。

图4 正常组和非酒精性脂肪性肝病各组小鼠肝脏组织中Notch1表达情况

3 讨 论

NAFLD是因肝脏脂肪合成和脂肪分解失衡导致过多脂肪酸不能被肝脏代谢所致的代谢应激性肝损伤。多种转录因子包括SREBP-1c和PPARs参与NAFLD的发病，其中SREBP-1c参与脂肪合成和TG聚集，而PPAR的激活可导致过氧化物酶体的增殖和随后的基因表达上调，如CPT-1、瘦素和胰岛素受体，从而减少脂肪生成和减轻胰岛素抵抗。本实验结果显示，高脂组小鼠肝细胞结构紊乱，肝细胞脂滴空泡、肝脏橘红色脂滴沉积均较多，血清TG、TC水平及肝脏组织中SREBP-1c mRNA相对表达量增高，肝脏组织中PPAR-α mRNA相对表达量降低；白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝脏病理改变明显好转，血清TG、TC水平及肝脏组织中SREBP-1c mRNA相对表达量均明显降低，肝脏组织中PPAR-α mRNA相对表达量均明显增高。提示白藜芦醇可抑制脂肪合成，促进脂肪分解，有助于改善NAFLD病理改变。

Notch信号从低等生物到灵长类动物高度保守，Notch信号通路参与NAFLD的病理过程。在肥胖和胰岛素抵抗小鼠模型中，Notch基因表达增加，会促进SREBP-1c介导的脂肪合成，导致NAFLD[7]。Ba等[8]研究发现，过表达Notch可通过下调PPAR-γ和PPAR-α表达而抑制脂肪分解。肝脏Notch信号存在于肝细胞中，其激活与机体代谢状态相关[9]，肥胖和NAFLD妇女存在肝细胞Notch信号失调[10]。阻断肝细胞Notch信号可同时抑制肝葡萄糖生成TG，从而减少肝脏脂肪堆积[11]。Zhao等[12]发现，姜黄素可以抑制 Notch 基因表达，从而下调SREBP-1c表达，上调PPAR-α表达，改善大鼠的脂质代谢。这些研究结果表明，Notch信号通路通过调控SREBP-1和PPAR-α转录因子的表达影响脂肪生成和脂肪分解。Xiao等[13]发现白藜芦醇可通过miR-139-5p / Notch1信号传导途径诱导骨肉瘤细胞凋亡发挥抗癌作用；Kim等[14]发现白藜芦醇可通过抑制Notch1和PTEN/Akt信号传导而诱导Caspase依赖性细胞死亡；Zhang等[15]研究证实白藜芦醇可以抑制Notch信号通路以减轻脊髓损伤。以上研究说明白藜芦醇可能通过影响Notch信号通路发挥作用。本实验结果显示，高脂组小鼠肝脏组织中Notch1蛋白表达量明显增高，提示NAFLD小鼠存在Notch1过表达；白藜芦醇低、高剂量组小鼠肝脏组织中Notch1蛋白表达量较高脂组明显降低，提示白藜芦醇可抑制NAFLD小鼠肝脏中Notch信号通路，从而下调SREBP-1c表达，上调PPAR-α表达，减轻肝脏脂肪病变。

综上所述，白藜芦醇可能通过抑制Notch信号通路，下调SREBP-1c表达抑制脂肪合成，上调PPAR-α表达促进脂肪分解，从而减轻NAFLD病理改变；Notch信号通路可能是一种潜在的新的NAFLD治疗靶点，有待进一步研究探讨。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。