电针对局灶性脑缺血大鼠皮质神经细胞铁死亡的影响

上官豪，徐 维，陈剑豪，黄炼红，葛舒颖，陈可爱，苏清平，张爱香

(1. 福建省立医院，福建 福州 350001；2. 福建医科大学附属第一医院，福建 福州 350005)

缺血性脑卒中具有高发病率、高病死率、高致残率的特点，发病后由于大脑血液及氧气供应迅速减少，立即出现神经元损伤，表现为细胞肿胀、裂解、细胞器游离等[1-2]。在脑缺血的动物实验及体外细胞实验研究中，通过电镜可观察到线粒体损伤，表现为形态损害、肿胀[3-4]。近年来，铁死亡在神经系统疾病中的作用受到广泛关注，众多学者通过对脑缺血损伤动物模型研究证实缺血性脑卒中可诱发铁死亡介导神经损伤[5-6]。因此，抑制铁死亡可改善脑缺血后神经损伤。电针结合了针灸和电生理刺激的优点，且具有简、便、廉、效的特点，已广泛应用于脑缺血的临床治疗。曲池、足三里穴分别为手足阳明经合穴，具有多气、多血的特点，是治疗中风较常用的2个穴位[7]。课题组前期研究表明电针曲池、足三里穴可缩小局灶性脑缺血大鼠脑梗死体积，促进神经损伤的恢复[8-9]，但是目前对其作用机制的认识还不十分清楚，很有必要从新视角深入探讨其改善脑缺血后神经损伤的作用机制。本实验探讨了电针曲池、足三里穴是否可通过抑制神经细胞铁死亡发挥神经保护作用。

1 实验材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠36只，体重(250±30)g，购于上海斯莱克动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养条件：温度21～25 ℃，湿度60%～70%，模拟标准日夜系统，自由饮食和饮水。所有实验操作均严格按照《中国实验动物管理法》进行，并获得动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂和仪器 2%戊巴比妥钠(美国Sigma)，TTC染色液体(2,3,5-Tripheny Tetrazolium Chloride，北京索莱宝科技有限公司)，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(上海碧云天生物技术公司)，3%戊二醛-1.5%多聚甲醛(北京中镜科仪技术有限公司)，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾(北京中镜科仪技术有限公司)；MCAO线栓(L3200，广州佳灵)，G6805型电针仪(上海华谊公司)，超薄切片机(EM UC7,Leica Microsystems, Germany)，透射电子显微镜(H-7650, Hitachi, Japanese)，超净工作台。

1.3实验方法 将36只大鼠编号，根据随机数字表法分成假手术组、模型组及电针组，每组12只。术前禁食，室温22 ℃条件下，模型组及电针组制备脑缺血损伤模型：采用2%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，取颈前正中2 cm纵向切口，钝性分离，暴露左侧颈总、颈内和颈外动脉及其分支，结扎颈外动脉及近心端颈总动脉。用微动脉夹夹闭颈内动脉后，在颈总动脉远心端剪一小口，并将已备好的MCAO线栓插入颈内动脉，顺势推送至大脑中动脉起始部，从分叉处插入18～22 mm，造成脑缺血。缺血2 h后，回抽线栓约10 mm，恢复灌注。假手术组仅分离左侧血管，不插线栓。判定造模成功后，电针组大鼠于术后第1天开始干预：捆绑法固定，参考《实验针灸学》[10]取大鼠患肢曲池穴(定位于桡骨近端关节外侧前方的凹陷中)、足三里穴(定位于大鼠后肢膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处)，消毒后，用华佗牌30号0.5寸针，斜刺0.2～0.3 cm，接G6805电针仪，选择疏密波，频率2/20 Hz，刺激以患体轻微抖动为度，30 min/次，1次/d，干预7 d；模型组及假手术组大鼠同等方法抓取固定30 min，但不电针干预。

1.4观察指标及方法

1.4.1神经功能 干预7 d后，由1名对本实验不知情的观察员，采用mNSS神经功能缺损评分[11]对各组大鼠进行神经功能评估，主要观察大鼠的运动(肌肉情况、异常行动)、感觉(视、触、本体觉)、平衡、神经反射和整体表现。

1.4.2脑梗死体积 干预7 d后，每组随机取大鼠6只，采用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，快速取脑组织，经冷冻后，沿冠状面切成2 mm厚的薄片(4～5片)，薄片置于配置好的TTC染色液中，37 ℃避光孵育15～30 min。梗死部分不着色，未梗死区域被染成红色。将脑组织切片拍照后，应用Image J图像分析软件计算每个脑组织脑梗死的总体积，计算脑梗死体积百分比(梗死体积/全脑体积×100%)。

1.4.3线粒体形态结构 干预7 d后，每组随机取大鼠6只，采用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，4%多聚甲醛行心脏灌流固定后，快速取脑，分离左缺血周围区皮质(1～2 mm3)，置入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定3 d(4 ℃)，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定2 h，磷酸盐缓冲液漂洗；经梯度脱水，环氧树脂618包埋。超薄切片(80 nm)，经醋酸铀、柠檬酸铅染色，采用H-7650型电镜观察线粒体形态结构并摄影。

2 结 果

2.1各组大鼠mNSS神经功能缺损评分比较 干预7 d后，模型组和电针组大鼠mNSS评分分别为(9.92±1.31)分和(7.42±1.31)分，电针组明显低于模型组(P<0.05)。

2.2各组大鼠脑梗死体积比较 假手术组大鼠无梗死发生；模型组大鼠脑梗死体积百分比为(23.20±3.24)%，电针组为(17.46±3.35)%，电针组明显低于模型组(P<0.05)。

2.3各组大鼠皮质神经细胞线粒体形态结构 假手术组大鼠皮质神经细胞线粒体(箭头标记为线粒体)形态结构正常；与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧皮质神经细胞线粒体损伤严重，形态结构萎缩，线粒体膜密度增加，嵴明显减少或消失，典型的铁死亡表现；与模型组比较，电针组大鼠神经细胞线粒体结构明显改善，呈轻度损伤，形态趋于正常，膜密度减小，嵴数目增加。见图1。

图1 假手术组和局灶性脑缺血大鼠缺血周围区皮质神经元超微结构(透射电镜，×25 000)

3 讨 论

脑卒中又叫中风，属于中医学“偏枯”“偏瘫”范畴，主要临床症状为猝然昏倒、不省人事、半身不遂等。清代医家王清任认为中风偏瘫的本源是“半身不达，亏损元气”，元气亏损大半，半身经络空虚而无血气濡养，则半身不能动用，发为偏瘫。因此治疗当以补气活血、疏通经络为主。《素问·痿论》提出“治痿独取阳明”的治法。曲池、足三里穴为阳明经之合穴，具有主润宗筋、通经络、调气血作用。《针灸大成》明确记载“半身不遂、中风：绝骨、昆仑、合谷、肩髃、曲池、手三里、足三里”。因此针灸曲池、足三里穴是治疗中风的有效方法之一。临床研究表明针灸曲池、足三里穴治疗缺血性脑卒中疗效显著且安全[12-13]。既往动物实验表明电针曲池、足三里穴可减轻缺血性脑卒中后的神经损伤，缩小脑梗死体积，减轻脑水肿[14-16]，本实验研究结果与上述研究结果一致。

铁死亡是一种新型程序性死亡，其特征是铁依赖性的、以细胞内脂质致活性氧积累导致的细胞死亡[17]。铁死亡通过使细胞膜上含不饱和脂肪酸长链的磷脂分子脂质过氧化，引起膜氧化损伤、破裂，致细胞死亡，形态学上铁死亡的典型特征为线粒体凝结或肿胀、膜密度增加、嵴减少或消失等[18]。近年研究发现铁死亡参与了缺血性脑卒中的发病，Li等[19]通过透射电镜观察到脑缺血神经细胞内铁死亡特征性线粒体改变。本实验也发现脑缺血模型组大鼠皮质神经细胞线粒体损伤严重，形态结构萎缩，膜密度增加，嵴明显减少或消失，表明脑缺血损伤中皮质神经细胞发生铁死亡。因此，考虑脑缺血损伤可能通过诱发铁死亡介导神经功能损伤。Tuo等[20]证实缺血性脑卒中导致脑组织铁离子明显升高，并通过铁死亡途径导致神经细胞死亡，而铁死亡抑制剂Liproxstatin-1或Ferrostatin-1治疗可改善神经损伤，提示抑制铁死亡可能具有一定神经保护作用。Tang等[21]发现针灸干预可抑制铁死亡、氧化应激起到抗炎保护作用。Li等[22]和Kong等[23]研究发现针灸可抑制脑出血大鼠神经元细胞铁死亡，改善神经功能。Li等[19]发现电针百会、水沟、双侧三阴交和双侧内关穴可以通过抑制铁死亡预防脑缺血后神经细胞死亡，从而减轻神经损伤。本实验也证实电针缺血性脑卒中大鼠曲池、足三里穴可抑制铁死亡，减轻神经细胞铁死亡表现。

综上所述，铁死亡介导了脑缺血后的神经损伤，铁死亡机制可能成为缺血性脑卒中治疗的新靶点。电针曲池、足三里穴可改善脑缺血大鼠神经功能缺损症状，缩小梗死体积，保护脑神经，机制可能与抑制神经细胞铁死亡有关，但其具体的效应机制有待深入研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。