归芪藤草膏对外阴慢性单纯性苔藓大鼠肝肾功能及Th1/Th2免疫机制的影响

李晶晶，陈 颖，王 阳，徐道立，刘春晖，王汝芹，佟 庆

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078；3. 武汉同济航天城医院，湖北 武汉 431400；4. 廊坊市中医院，河北 廊坊 065000)

外阴慢性单纯性苔藓(vulvar lichen simplex chronicus，VLSC)是发生于外阴皮肤的一种良性的慢性炎症性皮肤疾病，该病以外阴瘙痒难忍为主要临床表现，因其产生的瘙痒症状持续反复发作，会严重影响患者的生活质量[1-2]。目前研究认为VLSC可能是一种免疫功能失调性疾病，但具体的发病机制仍不明确[3-5]。现代中医医家认为VLSC发病原因多与湿、热、燥、风邪相关，涉及肝、肾、心、脾、肺，与肝肾二脏关系最为密切[6]。中医治疗多采用口服中药、中药外洗、针灸及穴位注射等[7]，但作用机制不明确，一直处于探索阶段。归芪藤草汤是国家级名老中医金哲教授治疗VLSC的经验方，该方以“血虚湿蕴”为立论基础，临床研究显示该方治疗有效率在80%以上[8]。本实验通过建立VLSC大鼠模型，观察了归芪藤草膏对外阴组织、肝肾功能及Th1/Th2免疫机制的影响，旨在阐释VLSC的发病机制及归芪藤草膏的可能治疗靶点。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级6～7周龄雌性SD大鼠40只，体重160～180 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，动物许可证号： SCXK(京) 2019-0010。于北京中医药大学东方医院动物实验中心，在干燥、无菌、空气流通、24 h光暗循环条件下统一饲养，常规喂食和饮水。适应性喂养1周。该实验操作符合动物伦理要求。

1.2主要药品及试剂 归芪藤草膏(由当归15 g、生黄芪30 g、藤梨根15 g、老颧草15 g、川芎10 g、蛇床子10 g、仙鹤草15 g、紫草10 g、薄荷6 g、透骨草15 g组成)，由北京中医药大学东方医院制剂室统一熬成膏，药剂室进行质量控制，将制成的归芪藤草膏于4 ℃冰箱中保存备用。二甲基苯并蒽(DMBA，美国Sigma 公司)，分析纯丙酮液(国药集团化学制剂有限公司)，甲苯胺蓝(北京化学试剂公司)，4%多聚甲醛固定液(北京华奥生物)，谷丙转氨酶(AST)、谷草转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)及白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒(均为武汉云克隆科技股份有限公司)。

1.3实验方法 大鼠适应性喂养1周后，随机取10只作为空白组，其余30只参照文献[9-10]方法进行造模：充分暴露大鼠外阴，用固定的硬毛牙刷刷大鼠外阴皮肤，刷至皮肤充血发红后，用勾线笔蘸0.5% DMBA丙酮溶液适量涂布于外阴皮肤，待其自然晾干后放回代养笼常规饲养。每周均于周一、周三、周五固定的时间给予处理，共处理8周，后自然观察2周。自然观察结束后的周日，以1%戊巴比妥钠溶液按照80 mg/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠后，用1%甲苯胺蓝溶液涂抹于外阴皮肤，晾干后用1%冰醋酸进行脱色，在不脱色处用皮肤钻环钻钻取皮肤组织，组织以4%多聚甲醛组织固定液固定、脱水、石蜡包埋、4 μm厚连续切片，HE染色后行光镜下观察，见慢性单纯苔藓样改变即为造模成功。将造模成功的大鼠按照随机数字表法分为归芪藤草膏组和模型组，每组13只。之后模型组给予蒸馏水外涂外阴，归芪藤草膏组给予归芪藤草膏外涂外阴(厚度约l mm，药物停留30 min)，涂抹后大鼠单笼放置，均每日1次，连续4周；空白组不给予任何干预。

1.4观察指标及方法

1.4.1外阴皮肤组织观察 最后一次干预2 h后,肉眼观察各组大鼠外阴皮肤情况；然后将大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，用1%甲苯胺蓝溶液涂抹于外阴皮肤，干燥后用1%冰醋酸擦洗脱色，在不脱色区用皮肤钻钻取组织，组织以4%多聚甲醛组织固定液固定、脱水、石蜡包埋、 4 μm厚连续切片，HE染色后行光镜观察。

1.4.2血液学指标检测 钻取外阴皮肤组织后，分离腹主动脉，取血液，3 000 r/min离心20 min后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。采用 ELISA 法检测血清中AST、ALT、BUN、SCr、IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-6水平，操作方法按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1各组大鼠外阴肉眼观察表现 空白组大鼠外阴皮肤颜色淡红，弹性良好。模型组大鼠于蒸馏水干预前较正常组大鼠皮肤颜色较红，触诊皮肤明显粗糙，弹性降低；蒸馏水外涂4周后皮肤颜色与干预相比未见明显改变，皮肤触诊仍较为粗糙，弹性差。归芪藤草膏组大鼠干预4周后皮肤颜色明显较模型组好转，触诊皮肤光滑有弹性，与空白组大鼠外阴皮肤外观大致相同。见图1。

图1 空白组和外阴慢性单纯性苔藓各组大鼠外阴皮肤表现

2.2各组大鼠外阴皮肤组织病理学表现 镜下见空白组大鼠外阴皮肤组织层次清楚，复层角化鳞状上皮细胞排列整齐，极性保持，基底层细胞明显；模型组大鼠复层鳞状上皮增生，角化层增厚，表皮角化过度，上皮层次增多，真皮层胶原纤维化并伴有炎细胞浸润，上皮细胞排列整齐，极性保持，基底层细胞明显；归芪藤草膏组92.3%(12/13)的大鼠外阴皮肤已经恢复正常，镜下见复层角化鳞状上皮，上皮细胞排列整齐，极性保持，基底层细胞明显。见图2。

图2 空白组和外阴慢性单纯性苔藓各组大鼠外阴皮肤组织HE染色表现(×100)

2.3各组大鼠血清ALT、AST、BUN、SCr水平比较模型组大鼠血清AST、BUN水平和归芪藤草膏组大鼠血清BUN水平均明显高于空白组(P均<0.05)，归芪藤草膏组大鼠血清ALT、AST水平均明显低于空白组(P均<0.05)；归芪藤草膏组大鼠血清ALT、AST、BUN水平均明显低于模型组(P均<0.05)；各组大鼠血清SCr水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和外阴慢性单纯性苔藓各组大鼠血清ALT、AST、BUN、SCr水平比较

2.4各组大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平比较 模型组大鼠血清IL-2 、IL-4、IL-6水平和归芪藤草膏组大鼠血清IL-4和IL-6水平均明显高于空白组(P均<0.05)，模型组大鼠血清IFN-γ水平和归芪藤草膏组大鼠血清IL-2、IFN-γ水平均明显低于空白组(P均<0.05)；归芪藤草膏组大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平均明显低于模型组(P均<0.05)，血清IFN-γ水平明显高于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 空白组和外阴慢性单纯性苔藓各组大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平比较

3 讨 论

中医学根据VLSC临床表现认为其属于“阴疮”“阴痒”“阴痛”“狐惑”等范畴。《肘后备急方·卷五》：“阴痒汁出，嚼生大豆黄，涂之，亦疗尿灰疮。”《诸病源候论·妇人杂病诸候》曰:“肾荣于阴器,肾气虚,不能制津液,则汗湿,虚则为风邪所乘,邪客腠理,而正气不泄,邪正相干,在于皮肤,故痒，搔之则生疮。”《医宗金鉴》记载“郁热伤损肝脾，气血凝滞，湿热下注，久而虫生所致”。现代中医医家多认为VLSC发生的主要内因是肝肾不足、血虚精亏，血虚风燥、脉络瘀阻是主要病机[11]。一项系统性评价研究认为，中药外用治疗外阴白色病变的疗效优于西药外用，治疗后复发率也更低[12]。且中药局部外敷可使药物通过局部皮肤直接渗透和吸收，改善局部血液循环，具有不经过肝脏的“首过效应”和胃肠道破坏的优势，作用时间长，使用方便。

归芪藤草膏从养血祛湿入手，方用当归养血活血润燥，藤梨根清热解毒、祛风除湿，两药共用，清湿毒而不伤正，养血气而不留邪，共为君药。生黄芪补中益气，托里透毒，使有形之血不易速生；老颧草属肝经，环阴器而通经络，祛风湿以散结；川芎活血通经，配合当归通利肝经血脉；三药共用加强君药养血祛湿之功。佐以蛇床子温阳气、祛风除湿、杀虫止痒，仙鹤草、紫草清热解毒，薄荷引药直达病所，提高全方透皮渗透吸收作用。全方养血气、祛风燥、利湿毒，标本兼治，使外阴得以滋养，肌肉得以充实，腠理更加致密，则瘙痒消散，外阴色泽恢复如常[13]。本实验结果显示，外用归芪藤草膏外用4周后，大鼠外阴组织HE染色见复层角化鳞状上皮，上皮细胞排列整齐，极性保持，基底层细胞明显，基本恢复正常，证实归芪藤草膏可明显改善VLSC大鼠皮肤损害。

AST、ALT是反映肝功能的重要指标，BUN、SCr是反映肾功能的重要指标。本实验研究发现，模型组大鼠血清AST、BUN水平和归芪藤草膏组大鼠血清BUN水平均较空白组明显升高；归芪藤草膏组大鼠血清ALT、AST、BUN水平均较模型组明显降低，且血清ALT、AST水平明显低于空白组；各组大鼠血清SCr水平差异不明显。提示VLSC大鼠的肝肾指标发生了一些变化，归芪藤草膏在一定程度上可影响大鼠的肝肾功能。查阅众多文献，目前尚未发现VLSC发病与肝肾功能关系的研究。究其原因，可能为VLSC本身为妇科与皮肤科的交叉病种，其所受的关注度较低；其次，VLSC作为外阴局部疾病，对于肝肾的影响并不甚显著。

辅助性 T 细胞在炎症性疾病的发病中起着非常重要的作用，其主要通过分泌多种细胞因子，调节其他类型免疫细胞的功能，从而发挥免疫效应功能[14]。根据细胞因子的分泌模式，辅助性T细胞可分为Th1和Th2亚群,Th1主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,并介导细胞免疫,如激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞,诱导迟发型超敏反应；Th2主要分泌IL-4、IL-6等细胞因子,并介导体液免疫,如激活B细胞和嗜酸粒细胞[15]。正常机体内,Th1/Th2网络维持着动态平衡，若Th1/Th2的平衡遭到破坏,即可引起机体的异常免疫,导致相关疾病的发生。 VLSC是慢性单纯性苔藓(神经性皮炎)的一种特殊类型，有研究表明,神经性皮炎的发生可能与Th1/Th2失衡有关，Th2参与了皮损的炎症反应[14]。本实验结果显示，模型组大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平和归芪藤草膏组大鼠血清IL-4和IL-6水平均较空白组高，模型组大鼠血清IFN-γ水平和归芪藤草膏组大鼠血清IL-2、IFN-γ水平均较空白组低；归芪藤草膏组大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平均明显低于模型组，血清IFN-γ水平明显高于模型组。说明VLSC大鼠存在着血清IL-2、IL-4、IL-6水平升高及IFN-γ水平降低的现象，而归芪藤草膏可下调VLSC大鼠血清IL-2、IL-4、IL-6水平和上调血清IFN-γ水平，但并无明显地向Th1或者Th2偏移，提示 VLSC的发生确实存在着某些炎性因子的改变，但是否存在Th1/Th2失衡需要进一步论证。

综上所述，归芪藤草膏能显著改善VLSC大鼠外阴皮肤病变，其作用机制可能与调节大鼠肝肾功能及Th1、Th2相关炎性因子水平相关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。