团羽铁线蕨HPLC-DAD指纹图谱的建立与多种特征成分含量测定

王 宇，林 肯，肖 丹，高 源*

(1.贵州省农业科学院 植物保护研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省印江县新寨镇卫生院，贵州 铜仁 555200；3.贵州省食品检验检测院，贵州 贵阳 550004)

团羽铁线蕨，又名猪鬃草，为铁线蕨科Adiantaceae铁线蕨属Adiantum植物Adiantumcapillus-junonisRupr.的全草，为少数民族地区常用药材，具有清热利尿、润肺止咳、补肾通络的功效[1]，其广布于全国多地，常见于贵州、云南、四川等地区[2]。常生长于海拔300～2500 m的湿润石灰岩壁石缝中、阴湿墙壁基部石缝中或荫蔽湿润的白垩土上。由于团羽铁线蕨药材现有质量标准较低，药材来源质量控制不佳，《贵州中药材、民族药材质量标准》(2003版)中未收录能反映药材质量的化学成分整体轮廓的指纹图谱[3]，且含量测定方法提取过程繁琐，不能全面反映铁线蕨药材的质量。因此，利用中药指纹图谱具整体性的特点，实现对中药内在化学成分的综合评价和整体质量的全面控制[4]。本研究利用指纹图谱技术与化学计量学分析，首次建立19个不同产地团羽铁线蕨药材指纹图谱与特征成分含量测定，并进行方法学研究，为提高药材质量标准奠定基础。本实验指认的槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-芸香糖苷属于黄酮类物质，黄酮类化合物在临床上有抗氧化、抗突变等作用，可用于高血压的辅助治疗，有防止脑溢血、循环器官疾病的功效[5-8]。

1 材料与方法

1.1 仪器

试验主要用到的仪器有电子天平(型号XS205DU；AL204)、超声仪(昆山市超声仪有限公司)、电热恒温水浴锅(AISITI)、回流提取器(上海南阳仪器有限公司)、waters e2695 高效液相色谱仪(waters)、DAD 二极管阵列检测器(waters)、Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色谱柱(安捷伦科技有限公司)、Waters XSelect®T3 色谱柱(沃特世科技有限公司)、SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱。

1.2 试剂

实验主要用到的试剂有甲醇、乙腈(GR，淮安科仪化玻有限公司)；甲酸、乙酸、磷酸(AR，天津市富宇精细化工有限公司)。槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸(成都普思生物科技股份有限公司，批号：MUST-19052825，纯度：99.72%)；山奈酚-3-O-芸香糖苷(成都普思生物科技股份有限公司，批号：MUST-19041507，纯度：98.16%)。

1.3 药材

实验所用药材来自不同省份的多个地区，部分为自行采集，部分为购买，详见表1所示。

表1 团羽铁线蕨的来源Tab.1 Sourcesof Adiantum capillus-junonis Rupr.

1.4 方法

1.4.1色谱条件

色谱条件参照文献记载[9]。

1.4.2样品及对照品制备方法

供试品制备：称取药材样本1 g置于锥形瓶，精确加入80%甲醇25 mL[10]，70 ℃条件下回流60 min，趁热过滤，于80 ℃水浴挥发至6～7 mL，定容至10 mL，过0.45 μm的微孔滤膜，待用。

标准溶液的制备：分别称取槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷标准品25 mg于小烧杯内，溶解转移至25 mL容量瓶中，分别使用80%甲醇定容至刻度，配置成浓度约为0.1 mg/mL的混合溶液。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱研究

2.1.1仪器精密度、稳定性、重复性考查及团羽铁线蕨HPLC方法完整性考查

取S15药材供试品溶液进样测定，以10号峰为参照峰计算得精密度相对保留时间RSD值为0.02%～0.05%、稳定性相对保留时间RSD值为0.05%～0.20%，重复性相对保留时间RSD值为0.05%～0.12%(均小于3%)，精密度相对峰面积RSD值为0.11%～2.95%、稳定性相对峰面积RSD值为0.14%～2.85%、重复性相对峰面积RSD值为0.10%～2.98%(均小于3%)；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)进行相似度评价分析，设置时间窗宽度为0.1，可得相似度均达到0.99以上，精密度RSD值为0.23%、其余为0；显示该方法仪器精密度、方法48小时稳定性、重复性良好。取S15药材制备6份供试品溶液，将100%甲醇洗脱时间调整到100 min，其余洗脱梯度不变，进样量为20 uL，未见有峰洗脱出来，说明本HPLC方法完整。

2.1.2建立图谱及特征峰指认

以S19药材图谱为参照图谱，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)，釆用平均数图谱生成法和多点矫正的方式，整合19批样本的指纹图谱数据，生成19批团羽铁线蕨HPLC叠加图谱与指纹对照图谱(图1、图2)，可见团羽铁线蕨80%甲醇提取液有13个相同的共有峰，通过与对照品(图3)比对，指认出共有峰2个，分别为槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-芸香糖苷，其余11个共有峰未被指认出。通过叠加图谱和指纹对照图谱，可知19批次样本的DAD指纹图谱相似度范围为0.558～0.901，平均值为0.756，RSD值为16.91%。以10号峰为参照峰，计算出19批次样本的相对保留时间RSD值为0.11%～0.99%，相对峰面积RSD值较大。

图1 19批团羽铁线蕨HPLC叠加图谱(S1-S19)与对照图谱(R)Fig.1 HPLC overlay atlas (S1-S19) and control atlas (R) of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

图2 指纹对照图谱Fig.2 Fingerprint control

图3 槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸(a)和山奈酚-3-O-云香糖苷(b)的对照色谱图Fig.3 contrast chromatogram of Quercetin-3-O-β-D-glucuronide (a) and Kaempferol-3-O-cloud carnosine (b)

2.1.3聚类分析

以10号峰为参照，以19批药材中13个共有峰的相对峰面积为变量，标准化组成19×13阶原始数据矩阵，通过SPSS 26软件进行聚类分析。利用组间连接法，以欧式距离作为样品的测度[11]，结果见图4，19批药材可聚为3类，其中S1、S2为一类，S3-S6、S11聚为一类，其余批次药材聚为一类。

图4 19批团羽铁线蕨聚类分析图Fig.4 Cluster analysis of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.1.4主成分分析

主成分分析(PCA)方法是一种能够从原始数据中提取出其共有特征的方法，通过构建主成分因子可以体现样本间相似性和原始数据对主成分因子的贡献[11-12]。以10号峰为参照，以19批药材样品中13个共有峰的相对峰面积为变量进行PCA分析，选择3个主成分，累积方差贡献率为85.6%，说明模型预测良好。由PCA得分图(图5)显示，19批药材样品可分为3类，S1、S2聚为一类，S3-S5、S11、S6聚为一类，其余产地聚为一类。

图5 19批团羽铁线蕨PCA得分图Fig.5 PCA score chart of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.1.5正交偏最小二乘法判别分析 (OPLS-DA)分析

不同产地的团羽铁线蕨药材样品集中在不同区域，19批药材样品可分为3组(图6)，S1、S2聚为一组，S3-S5、S11、S6聚为一组，其余产地聚为一组，与PCA分析、聚类分析结果一致。OPLS-DA模型(图7)中的拟合参数R2X=0.851，R2Y=0.966，模型预测参数(Q2)=0.903，均大于0.5，表明所建模型稳定且预测能力较强。以模型变量投影(VIP)值为指标对引起组间差异的成分进行分析，筛选贡献较大的8个变量(以VIP值>1为标准)，从大到小依次为11号(VIP=1.20455)>8号(VIP=1.12766)>1号(VIP=1.11016)>3号(VIP=1.06954)>10号(VIP=1.05879)>7号(VIP=1.04475)>12号(VIP=1.03037)>6号(VIP=1.02963)，提示引起19批药材样品质量差异的为上述8个成分[13]。

图6 19批团羽铁线蕨OPLS-DA得分图Fig.6 OPLS-DA score chart of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

图7 19批团羽铁线蕨OPLS-DA模型中共有峰的VIP值Fig.7 VIP value of common peaks in OPLS-DA model of 19 batches of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.2 特征成分含量测定

2.2.1含量测定方法

在指纹图谱研究的基础上，由于有部分产地特征成分分离度不足以满足含量测定的要求，且指纹图谱方法测试时间太长，不符合试验经济学，故调整洗脱梯度为甲醇(A)-0.05磷酸水溶液(B)(0～30 min，30%～48%A)。

2.2.2专属性考查

取空白溶液及供试品溶液进样测试，如图8所示，空白溶液不干扰特征成分槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷槲2个成分，说明方法专属性良好。

2.2.3线性考查

进样分析并记录2个成分的不同浓度峰面积。以X轴为对照品浓度，Y轴为峰面积进行线性回归计算。结果可得，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸在0.01100～0.2200 mg/mL范围内呈良好线性关系，回归方程为y=724 515x-38 962，R2为0.997；山奈酚-3-O-芸香糖苷槲在0.01017～0.2034 mg/mL范围内呈良好线性关系，回归方程为y=806 074x-22 310，R2为0.998，表明对照品在相应浓度范围内线性关系良好。

2.2.4精密度、重复性、稳定性考查

取S15产地药材进样测定，分别记录2个成分的峰面积，并计算其RSD值，特征成分槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷槲的精密度RSD值分别为1.81%、0.90%，稳定性RSD值为1.39%、1.38%，重复性RSD值为2.39%、2.24%。结果表明，仪器精密度良好，48 h内方法稳定性，重复性良好。

2.2.5回收率考查

取S15产地药材9份，每份0.5 g,分为三组，每一组的3份以80%、100%、120%比例分别加入槲皮素-3-0- β -D一吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-0-芸香糖苷懈2种对照品，进样测试并记录。结果显示，槲皮素-3-0- β -D-吡喃葡糖苷酸、山奈酚-3-0-芸香糖苷槲平均回收率分别为102.5%、95.1%，RSD值分别为1.60%、2.65%。符合《中国药典》(2020版)四部中附录(9101)分析方法验证指导原则[14]，可用于铁线蕨2种特征成分含量测定。

注：a为供试品图谱;b为对照品图谱;c为空白图谱。图8 团羽铁线蕨专属性实验Fig.8 Specificity experiment of Adiantum capillus-junonis Rupr.

2.2.6含量测定结果

分别精密称定19批次药材1 g，进样测试并记录峰面积，通过标准曲线进行定量，记录槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量，结果见表2，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸含量范围为0.11～4.35 mg/g，山奈酚-3-O-芸香糖苷量范围为0.15～10.35 mg/g。

表2 样品含量测定结果Tab.2 Determination of sample content

3 结论与讨论

本文章主要研究了团羽铁线蕨化学指纹图谱及特征成分含量测定。通过方法学考察，调整确定流动相梯度，得到了19批次不同产地团羽铁线蕨的HPLC-DAD指纹图谱，并定量检测槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸和山奈酚-3-O-芸香糖苷两个物质的含量，本研究首次建立了团羽铁线蕨指纹图谱与含量测定方法，实验具有较大创新意义。

团羽铁线蕨在西南地区产地较多，药材丰富，从结果中可以看出，西南地区云贵川三省产地团羽铁线蕨药材HPLC-DAD指纹图谱相似度较好，但其余各省相似度较差，说明团羽铁线蕨生长环境对其化学成分含量影响较大，西南地区特有的气候、土壤环境使得团羽铁线蕨化学成分与其他省份差异较大，文献研究也指出了西南地区的生物气候环境非常适合于铁线蕨的生长繁殖[2]。19个团羽铁线蕨产地数据显示，共有峰相对保留时间RSD值较小，说明19批药材团羽铁线蕨化学成分基本一致，但共有峰相对面积RSD值较大，其RSD值最高达131.61%，说明19批团羽铁线蕨成分含量差异较大，推测原因为：(1)团羽铁线蕨样品本身化学成分的差异较大；(2)与样品不同采摘期有关，本实验样品由药材供应商提供，无法对采摘期进行控制，今后的试验将会进一步针对研究不同采摘期团羽铁线蕨化学成分差异进行报道。