猕猴桃花、幼果微生物群落及病害感染途径初步分析

李 勇，陈海江，许 粟，吴文能

(贵阳学院 食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005)

近年来，贵州省猕猴桃产业规模进入全国前三，随着种植面积增加，由病原微生物引起的猕猴桃病害日益突出，造成重大经济损失。由细菌引起的猕猴桃病害有细菌性溃疡病、花腐病，由真菌引起的有黑斑病、褐斑病、叶斑病、炭疽病、根腐病等。这些致病菌可危害猕猴桃的果实、叶片、根等部位。目前关于猕猴桃微生物的病害集中于病原菌的分离纯化，辅以侵染试验等，缺乏微生物群落对比及感染途径分析。对致病微生物是何时，通过何途径侵染到植株的研究仍然较为欠缺。目前针对微生物群落的调查有多种方法，如传统培养结合微生物形态学鉴定和生理生化鉴定，或结合PCR手段如限制性片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等。以及一些非培养方法，如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、实时荧光PCR、荧光原位杂交(FISH)等。这些技术均存在耗时、费力、结果可靠性差等缺陷。本研究利用的Illumina NovaSeq 测序平台，具有测序通量高、周期短、准确率高、成本低等优点，在微生物多样性研究中有显著优势。本研究通过Illumina NovaSeq高通量测序平台对猕猴桃花、健康幼果和患病幼果的微生物进行测序，比较样品中群落结构差异，分析微生物群落结构变化，为揭示患腐烂病猕猴桃的病原菌种类及感染途径提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集和命名

本研究猕猴桃品种为贵长，属贵州省自主选育并主要推广品种。采样地点为贵州省修文县，采集猕猴桃健康无病害的花朵、健康幼果及患病幼果，患病幼果症状为在果柄处开始出现腐烂迹象，并逐渐蔓延。采集后的样品装入样品袋，低温运输到实验室，并在12 h内对样品进行处理，无病害的猕猴桃花命名为MHTH，健康幼果命名为MHTG-1，患病幼果命名为MHTG-2。

1.2 基因组 DNA 提取及多样性分析

分别提取各组样品的基因组DNA，对其进行琼脂糖凝胶电泳以检测DNA的纯度和浓度。取适量样本DNA稀释浓度至1 ng/μL，根据所选择的测序区域，分别以其为模板，使用带有Barcode的特异性引物，以及PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs公司)对细菌的16S rDNA V3-V4区及真菌的ITS1区进行PCR。检测PCR产物浓度，并根据浓度进行等量混样，通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物，对目的条带使用胶回收试剂盒(QIAGEN公司)回收产物。最后利用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，质量检测合格后使用NovaSeq6000平台进行样品的测序工作。

1.3 数据处理

对高通量初始数据进行处理，利用FLASH(V1.2.7)对每个样本的reads进行拼接，经过严格过滤处理得到高质量Tags数据。然后用Usearch软件对所有样品有效序列以97%一致性将序列聚类成为OTU；用Mothur和SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，对获得分类学信息分别在各个分类水平统计样本群落组成。使用Qiime软件计算Shannon、Simpson、Chao1、Goods-coverage指数，使用R软件绘制图像和Alpha和Beta多样性指数差异分析。

2 结果与分析

2.1 序列长度分布

对各样品中细菌16S rDNA的V3-V4区进行测序，共获得266 533条平均长度为411 bp的高质量序列(图1)，基本符合16S rRNA基因的V3-V4区序列长度(460 bp)。对样品中真菌18S rDNA的ITS1区域进行测序，共获得260 919条平均长度为274 bp的高质量序列(图1)，与ITS1区域长度(260 bp)基本一致。

2.2 样品复杂度分析

样品中分别针对细菌和真菌测序结果的稀释度曲线如图2所示，从图2可以看出，随着测序数量的增加，稀释曲线斜率均逐渐降低，趋于平坦。根据曲线最终趋势可以看出，对样品中真菌测序深度较高，增加测序数量也只会产生少量新OTU。而对细菌继续增加测序数量，可能还会产生新OTU。由表1也可得出同样结论，测序深度指数中Good′s coverage代表了各样品文库的覆盖率，其数值越高，样品中未被测出序列概率越低，真菌测序的Good′s coverage均为1，3个样品中细菌此数值分别为0.996、0.996、0.995。Shannon指数和Simpson指数(本文分析使用Simpson′s Index of Diversity，即1-D)均是用来估算样品中微生物多样性的指数，此二者数值越高，说明样品中微生物群落的多样性越高，样品MHTG-2的细菌和真菌多样性均高于其他两个样品，在真菌中更加明显。ACE指数和Chao1指数均是用来估算样品中含有的OTU数目，表示群落丰富度，二者算法不同，Chao1和ACE指数越大，说明群落中含有的OTU数目越多，样品中物种丰富度越大，对比发现MHTG-2的细菌和真菌多样性均高于其他两个样品。

注：a为细菌；b为真菌。图1 序列长度分布Fig.1 Distribution of sequence length

注：a为细菌；b为真菌。图2 稀释度曲线Fig.2 Rarefaction curve

表1 样品中微生物多样性指数Tab.1 Microbial diversity index

2.3 OTU聚类分析及维恩图分析

对宏基因组测序后的数据进行分析，所有样品共获得细菌Tags(过滤后得到的拼接序列数)173 338条，包括164 970条可获得分类信息的Tags，7882条低频Tags。共获得真菌Tags 191 499条，包括187 177条可获得分类信息的Tags，3354条低频Tags。对拼接的数据进行优化，在97%相似度下将其进行聚类为用于物种分析的OTU，MHTH、MHTG-1、MHTG-2样品获得的细菌OTU个数为805、746和895(图3)，获得的真菌样本分别是99、43和168(图4)。比较3个样品中检测到的Tags数目以及OTU数目，健康的猕猴桃幼果MHTG-1稍低，但无显著性差异。

图3 样品中的细菌Tags和OTUs数目统计Fig.3 Statistics of the bacterial numbers of tags and OTUs in samples

图4 样品中的真菌Tags和OTUs数目统计Fig.4 Statistics of the fungal numbers of tags and OTUs in samples

3组样品的细菌、真菌韦恩图如图5所示，MHTF、MHTG-1、MHTG-2分别独有212、140、238个细菌OTU，以及40、7、83个真菌OTU。3组样品分别共有374和26个细菌和真菌OTU，样品MHTG-2中无论是细菌还是真菌类群独有OTU都是最多的。

样品中的测序数据可以注释到细菌门平均28个，细菌属平均212个，以及真菌门平均3个，真菌属平均53个(表2)。3个样品中细菌类群较为接近，样品MHTG-2中真菌在纲、目、科、属水平上均为最高。

表2 细菌、真菌分类数目Tab.2 Number of bacteria and fungi classification level

2.4 细菌物种多样性分析

图6列出了细菌门和属分类水平上物种丰度排名前十的分布状况，结果表明，3个样品中细菌的主要门类为变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidota、放线菌门Actinobacteria、unidentified Bacteria和厚壁菌门Firmicutes，其余门类的相对丰度均小于1%，优势菌均为变形菌门Proteobacteria(74.98%以上)。在属分类水平上，各组的优势属类为寡养单胞菌属(8.14%～44.48%)、假单胞菌属(12.86%～16.85%)、---属(3.96%～12.79%)、泛菌属(3.55%～9.06%)，此四者均为变形菌门Proteobacteria。

图6 细菌门和属分类水平相对丰度排名前十的物种分布Fig.6 Abundance (top 10) of bacteria in samples at phylum and genera level

根据猕猴桃生长阶段和患病状况不同进行对比分析，在门分类水平上MHTH及MHTG-1群落结构较为简单，优势菌为变形菌门Proteobacteria，相对丰度分别为88.43%和94.79%，患病猕猴桃MHTG-2除变形菌门Proteobacteria外，拟杆菌门Bacteroidota、放线菌门Actinobacteria相对丰度也较高，均为10%左右。在属分类水平上，除假单胞菌属相对丰度均较高外，其他属微生物相对丰度变化较大。样品MHTH中占比最高的为，相对丰度为22.33%，样品MHTG-1和MHTG-2中占比最高的均为寡养单胞菌属，相对丰度分别为44.48%和19.34%。

注：a为细菌;b为真菌。图5 细菌和真菌韦恩图Fig.5 Venn graphs of bacteria and fungi

2.5 真菌物种多样性分析

图7列出了真菌门和属分类水平上物种丰度排名前十的分布情况，由图可知，3个样品中真菌的主要门类为子囊菌门Ascomycota(95.90%～99.20%)，相对丰度占绝对优势。在MHTG-2中担子菌门Basidiomycota含量也较高，相对丰度为3.22%。其余门类的相对丰度均小于1%。

图7 真菌门和属分类水平相对丰度排名前十的物种分布Fig.7 Abundance (top 10) of fungi in samples at phylum and genera level

在属分类水平上，样品MHTH和MHTG-1中微孢子属为优势菌群，相对丰度分别为98.24%和96.37%，其余属相对丰度均小于1%。样品MHTG-2中相对丰度较高的有微孢子属、枝孢菌属、小双腔菌属、不整小球囊菌属、镰孢菌属、格孢菌属、附球菌属、unidentified、维希尼克氏属、，相对丰度分别为39.28%、18.47%、15.06%、8.68%、3.22%、3.18%、1.67%、1.65%、1.39%、1.11%。

3 结论与讨论

本研究利用高通量测序的方法对不同生长时期、不同健康状况样品中微生物群落进行分析。发现3个样品中细菌类群微生物群落结构相差较小，丰度较高的属均为寡养单胞菌属和假单胞菌属。寡养单胞菌属是一类革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，该属未发现有植物致病菌存在。假单胞菌属已知有191个种，多为植物致病菌，如浅绿黄假单胞菌、沙氏极毛杆菌、萤光假单胞菌、丁香假单胞菌的致病变株丁香致病变种pv.及丁香假单胞菌猕猴桃致病变种pv.均为猕猴桃致病菌，但这几种微生物均未在本次测序结果中发现。

真菌群落的研究中，样品MHTH和MHTG-1在属分类水平上群落结构相似，与患病样品MHTG-2群落结构相差较大。前二者微孢子属占绝对优势，该属研究较少，有些种可引起植物干粉病，但未见到有关猕猴桃致病菌的报道。MHTG-2除微孢子属外，枝孢菌属、小双腔菌属、不整小球囊菌属、镰孢菌属、格孢菌属、附球菌属、unidentified、维希尼克氏属、相对丰度也较高，可见患病猕猴桃中真菌群落结构较复杂，并可初步得出，患病猕猴桃属于真菌性致病菌感染。

可导致猕猴桃患病的真菌性致病菌种类较多，如属就有尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和三线镰刀菌，三者均可导致猕猴桃软腐病；亚隔孢壳属属可导致猕猴桃患黑斑病。本研究发现，在样品MHTG-2中发现互隔链格孢菌和茎点霉菌sp.相对丰度较高，分别为3.18%和1.03%，这两种微生物并未在样品MHTH和MHTG-1中发现。互隔链格孢菌是一种常见的猕猴桃致病菌，可导致猕猴桃患黑斑病和贮藏期软腐病，茎点霉菌sp.同样可导致猕猴桃软腐病。

猕猴桃软腐病常见于贮藏期，通常果实外表无明显症状，但随着储存时间增长，猕猴桃内部开始腐烂。通过本研究发现，虽然猕猴桃花和健康的幼果中没有发现相关致病菌，但幼果可被感染并且发病，推断果园环境中存在相关致病微生物，可感染幼果或成熟果，待条件合适时大肆繁殖，导致发病，发病时期可在生长期，或在贮藏期。下一步可对猕猴桃环境中的样品采样并进行高通量分析，以对本研究推测进行确认。同时指导种植户在猕猴桃种植园区喷施真菌杀菌剂，防范猕猴桃在生长、采摘、运输过程中的感染。

病原菌的入侵使微生物的多样性和丰富度均增加，在真菌群落结构中尤其明显。样品中未发现致病细菌，发现多种致病真菌，推断由果园环境感染。高通量测序获得大量微生物群落结构信息，为系统分析病原菌的入侵和潜在病害研究提供可靠依据。