环介导等温扩增(LAMP)技术在果树病毒病检测中的应用

罗丽婷，蒋君梅，李向阳，谢 鑫*

(1.贵州大学 农学院/农业微生物特色重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

果树是指能提供可供食用的果实、种子的多年生植物及其砧木的总称。其果实不仅含有丰富的维生素营养，而且能够促进消化，因而深受人们的喜爱。自改革开放以来，我国果树产业发展迅速，现已成为世界果树产业第一大国，种植面积和产量都居世界首位。果树病害频发是目前制约果树产业发展的主要原因，病毒是其最常见的致病因子，据报道，目前已发现900多种病毒可引起植物病害，造成的经济损失可高达600亿美元。早期诊断是减少病害损失，阻止病害进一步传播的有效方法。但由于病毒个体微小，结构简单，只含有一种核酸(DNA或RNA)，无法用光学显微镜观察，使得病毒诊断存在较大的局限性。随着时间的推移与研究的不断深入，病害诊断领域发生了巨大的变革。从标本中分离和鉴定病原，到血清学鉴定的出现，再到酶联免疫吸附剂测定方法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)等检测方法的出现。检测效率和灵敏度虽都有不同程度的提高，但昂贵的仪器和繁琐的扩增后处理过程使其应用受到一定程度的影响。直至2003年环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)被用于植物病毒病的检测，才有效地解决了上述问题，该方法不仅操作简单，而且其灵敏度及效率也高于传统的ELISA及RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)检测技术。从2003年至今，LAMP技术已被用于检测47个属的100多种病毒。此外，逆转录环介导等温扩增(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)也已在2个科8个病毒属中进行检测。本文将从LAMP技术的原理出发，重点梳理LAMP技术在果树病毒病检测中的应用，讨论其优缺点，并对LAMP技术在植物病害防治中的应用进行了展望。

1 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP是由Notomi和同事设计和开发的一种用于基因诊断和恒温核酸扩增的方法，最初用于检测乙型肝炎病毒的DNA。该方法所涉及的嗜热脂肪芽孢杆菌(，Bst)DNA聚合酶在60～65 ℃的等温条件下约有60 min的自动循环可置换DNA合成，因此需要由一组专门设计的特异性目标引物启动，用于识别目标DNA上的特定区域。LAMP检测引物至少包括正向及反向外引物(F3和B3，仅在非循环步骤中具有链位移活性)、正向及反向内引物FIP和BIP，有助于环的形成，其中FIP由F1c和F2两部分组成；BIP由B1c和B2两部分组成；F1c和F2c与目标序列中的F1和B1区域互补；有时还包括两种环引物(LF和LB)以加快LAMP反应效率。LAMP引物是针对每个病原体的目标核酸序列(DNA或RNA)而设计的，通常使用Primer Explore(https://primerexplorer.jp/e/)在线网站设计。

LAMP反应过程(图1)包括三个步骤:(1)初始步骤：FIP针对特定的互补序列，开始DNA合成。在目标序列的另一端，BIP的DNA扩增也以同样的方式进行(图1-a，1-2)；(2)环结构生成：F3进入目标区域，在Bst酶的置换作用下，FIP链被取代，形成一个扩增循环的模板。通过两个连续的扩增周期，即可合成含有目标序列的DNA片段，其末端为环状结构，用于循环扩增步骤的模板(图1-a，3-5)；(3)循环放大：类似于初始和环结构产生步骤，但环结构作为单链模板。在每个循环中，对于每个单链DNA模板，都会有两个扩增产物，其中一个与模板相同，另一个是模板长度的两倍。最终得到花椰菜状混合产物，可通过多种方法检测，如：双链DNA(dsDNA)结合染料、浊度测量、紫外光照射、实时荧光、凝胶电泳等方法检测(图1-b，6-11)。

2 LAMP技术在果树病毒病检测中的应用

2.1 苹果病毒病

苹果(Mill.)是全球最重要的果树作物之一，为落叶乔木。苹果病毒病是制约苹果可持续生产的一大威胁，如苹果褪绿叶斑病毒(，ACLSV)和苹果茎沟病毒(,ASGV)是使苹果产业严重受损的主要病毒。ACLSV和ASGV在感病果树体内浓度很低，且一般不产生明显症状，因而防治较为困难。目前主要通过使用高灵敏的检测方法对苗木进行病毒检测，从而及时对病害进行防治。传统的ELISA和 RT-PCR技术都可快速识别和区分致病因子，防止病害进一步传播。然而，在某些情况下，ACLSV和ASGV在感病苗木中含量甚至会低于ELISA和RT-PCR的最低检测限度，使得苹果褪绿叶斑病和苹果茎沟病一直未得到有效的防治。

注：(1)靶标DNA从FIP开始合成到其特定的互补序列B3c为止；(2)F3引物进入B3c序列并开始延伸；(3)在Bst酶作用下，从FIP开始合成的链被替换并成为下一个扩增周期的合成模板；(4)从BIP合成DNA；(5)包含目标序列的DNA片段扩增完成；(6)-(7)FIP引物在F2c位点与模板配对，扩增至与模板链相同长度；(8)模板链在B1c位点处合成至达到原来长度的两倍；(6)-(11)同上述步骤，在Bst酶的作用下每条模板链合成两条以上新DNA链。其中一条与模板长度相同，另一条长度为模板链的两倍。图1 LAMP反应原理及流程Fig.1 LAMP reaction principle and amplification process

为有效解决上述问题，Zhao等、Kim等于2014年建立了一种简单、灵敏的RT-LAMP检测方法，利用设计的外壳蛋白基因引物(表1)，快速检测ASGV。结果显示，RT-LAMP检测出53个被侵染的苹果叶片样品，而RT-PCR检测出49个被侵染的叶片样品。并通过与ACLSV和苹果茎痘病毒(,ASPV)的交叉反应，确定了RT-LAMP引物具有特异性。2017年，Peng等首次建立ACLSV的RT-LAMP体系。在多次试验后确定其最佳反应温度为64 ℃，最佳反应时间为75 min(表1)，并在现场采集的苹果样品上成功检测出病毒。不同于传统的检测技术，RT-LAMP灵敏度高，简单易行，成本低廉，可在简单的现场条件下轻松进行，适用于野外条件下及在许多发展中国家进行感染样品的快速检测，目前已得到越来越广泛的应用。

2.2 番木瓜病毒病

番木瓜(Linn.)又名木瓜,是最具经济价值的番木瓜科水果，营养价值与药用价值都极为丰富，广受人们的喜爱，在我国南方多地均有种植。但近年来，番木瓜病毒病频繁发生，严重阻碍了番木瓜的高产与优产。番木瓜环斑病毒(,PRSV)，于1949年在美国被首次报道，属于马铃薯Y病毒属()，有PRSV-P和PRSV-W两种类型。该病毒在自然界中极易传播，已成为全球性的制约番木瓜生产的重大病害，曾在中国华南地区大规模流行，一度被认为是危害中国木瓜生产最广泛和最具破坏性的病害。此外，与PRVS同属的番木瓜变形花叶病毒(-,PLDMV)因引起的病害症状与PRVS相似，最初被认为是PRSV。病毒基因通过同源性依赖的转录后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)获得的转基因抗性是迄今为止保护植物免受包括PRSV在内的病毒感染的最有效途径。而PLDMV却可侵染中国台湾和海南岛的抗PRSV转基因番木瓜，对中国番木瓜商业化生产构成了严重威胁。在经过病毒的血清学诊断和全基因组测序后发现，PLDMV为一个独立的种。为了区分PLDMV和PRSV，已建立ELISA、Western blotting和基于PLDMV基因的RT-PCR等鉴别方式，但效果均不太理想。因此，有必要开发一种快速、灵敏、经济的检测PLDMV的方法。2013年Shen等基于PLDMV的保守序列设计了4条RT-LAMP引物(表1)，建立PLDMV的RT-LAMP检测方法，通过RT-LAMP检测试验，仅在PLDMV感染样本的RNA提取物中获得阳性结果，因此较好地区分了这两种病毒。

对于PRSV基因，过去常用RT-PCR进行检测，但近年来由于PRSV转基因抗病品种培育的增多，以往的检测方法已难以完全区分各转基因品种与感PRSV的番木瓜。研究人员在之前的研究的基础上，对GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中保存的22个PRSV-P和PRSV-W菌株的基因组序列进行序列比对，发现3基因包含一个高度保守的区域(3552-3736 bp)，还尚未用于转基因番木瓜抗PRSV基因的开发。以此区域设计LAMP引物靶点，成功设计出了对感PRSV植株病毒RNA有特异性和敏感性的引物(表1)，且对PLDMV的检测不具有特异性和敏感性。通过检测PRSV即可区分转基因番木瓜、感PRSV番木瓜和感PLDMV番木瓜。该方法结合早期开发的PLDMV RT-LAMP检测方法，为区分木瓜病毒感染提供一个快速、可靠、敏感和经济的诊断工具。

2.3 樱桃病毒病

樱桃(spp.)为蔷薇科、樱属植物的统称，营养丰富，含丰富的蛋白质、糖类、维生素及钙、铁等多种元素，享有“早春第一果”的美誉。世界上作为栽培的樱桃仅有樱桃((Lindl.) G.Don)、欧洲甜樱桃((L.) Moench.)、欧洲酸樱桃(Mill.)和毛樱桃((Thunb.) Wall.)4个种类。甜樱桃是近几年来在我国发展较快的果树之一，其种植面积逐年扩大，但由于栽培过程中的操作不当，尤其对病毒病的重视及预防力度不够，严重影响了樱桃果品的产量与品质。

目前，国内报道的甜樱桃病毒病已有14种，主要为樱桃小果病毒1(,LChV-1)、樱桃小果病毒2(,LChV-2)和ACLSV等。LChV-1与LChV-2致病力极强，在大多数樱桃种植区均有发现，被认为是造成樱桃经济损失的主要原因，目前尚未找到较好的防治方法，只有通过清除感病的苗木才能控制，需要高效、灵敏、准确的检测方法为其提供保障。传统的检测技术，如：RT-PCR、ELISA等大都存在灵敏度低，操作复杂的问题。因而，研究人员选择建立LChV-1与LChV-2的RT-LAMP体系。研究发现，RT-LAMP技术在10 min内就能检测出LChV-1，在67 ℃下进行时效果最佳(表1)。现场检测病叶结果显示RT-LAMP检测速度较RT-PCR显著提高，灵敏度至少提高了100倍。在对从甜樱桃中分离出的LChV-2进行广谱检测，还发现了其潜在的昆虫媒介。该研究成果为LChV-1与LChV-2在现场快速诊断应用奠定了基础，为樱桃的商业化发展提供了技术支持。

2.4 葡萄病毒病

葡萄(L.)是世界上产量第二大的水果，是世界最古老的果树树种之一。近年来，葡萄栽种面积的持续扩大的同时，也造成了葡萄病毒病的快速传播。到目前为止，已有超过60种病毒在葡萄中发现，严重制约了葡萄产业的发展。据血清学调查显示，多种葡萄病毒病都是由一种单一病毒所引起——葡萄扇叶病毒(，GFLV)。GFLV是已知最早的葡萄病毒，葡萄受侵染后其叶片会退化，导致高达80%的产量损失。预防一直以来都是控制病毒病最重要的方法，但因GFLV在世界范围内的广泛分布，导致预防效果一直欠佳，这对病毒检测技术提出了更高的要求。研究人员通过对双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、RT-PCR、免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC- RT-PCR)、RT-LAMP、免疫捕捉反转录环介导等温扩增方法(IC-RT-LAMP)等几种检测方法的评估发现，IC-RT-LAMP为目前检测GFLV基因的最佳方法(表1)。该检测方法所需时间最短，且操作简便,避免了毒性染色材料的使用,可直接用肉眼进行视觉检测，提高了安全性的同时也降低了成本。

长期以来，尽管人们已对葡萄的主要病毒病有了一定了解，如由GFLV引起的病害，但影响葡萄健康和产业发展的新病毒仍在不断出现。包括葡萄红斑点病毒(，GRBV)，于2008年首次在美国加州出现，2012年首次从患病葡萄中提取出该病毒。由其引起的葡萄红斑病，广泛分布于北美葡萄种植区，可导致葡萄产量严重降低、成熟期大幅缩短。此前，果农一直都通过定期检测和清除病株的方式来管理葡萄园，往往不能及时发现病害，而导致损失严重。直到2019年研究人员建立了一种不需要提取核酸，使用无菌移液管尖端穿刺植物体，即可在无菌蒸馏水中孵育LAMP反应所需模板的技术。试验结果显示，“针刺”LAMP检测方法具有100%的敏感性和96.3%的特异性，进一步使用葡萄红斑伴随病毒等温扩增检测试纸条(AmplifyRPAcceler8for GRBaV Rapid DNA Test)对GRBaV进行检测。结果与“针刺”LAMP检测一致，表明“针刺”LAMP检测法具有实用性与广谱性。

2.5 西番莲病毒病

西番莲(L)别名百香果，因其香气浓郁，营养、药用价值高，而深受消费者的喜爱，有“果汁之王”的美誉。又因其适应性强，种植还具有“短、平、快”的特点，近年来全国种植面积持续增加。目前，西番莲多为引种栽培，在栽培生产过程中，常常会受到病虫害的威胁。其中，病毒病对西番莲产业的发展危害最大，据报道，现已有超过25种病毒可侵染西番莲。夜来香花叶病毒(,TeMV)为病毒，该病毒首先在越南发现可侵染夜来香属植物(Cov.)，2014年通过检测在西番莲中发现了该病毒。西番莲受TeMV侵染后，其果实和叶片会出现变形及皱缩等症状，使其产量和品质受到严重影响。现在，大都选择通过筛选无毒果苗来防治病毒危害，但由于早期植株受病毒侵染后不表现出明显的症状，从而采用ELISA、PCR及LAMP等方法来检测植物病原物。

不同于传统的检测方法，如ELISA、PCR等，LAMP因其具有检测速度快、灵敏度高和无需专业仪器等优点，而被广泛用于各种病原体的检测。为了减少西番莲产业的损失，加快无毒苗的筛选，Fu等于2021年首次将LAMP技术应用于西番莲TeMV的检测，并成功建立西番莲LAMP快速检测体系(表1)。研究发现RT-LAMP检测技术与RT-PCR相比具有显著优势，其灵敏度与效率高，特异性强，此外还可直接在田间使用。为西番莲的有效防治提供了极其有力的保障。

表1 LAMP在果树病毒检测中的应用Tab.1 Application of LAMP in fruit tree virus detection

续表1

3 总结与展望

自2000年LAMP技术被首次报道以来，已被广泛应用于动物、植物和人类样本的病原体检测的多个方面。与其他技术相比，LAMP具有一些显著的优势，使其在诊断方面具有竞争力。首先，LAMP检测速度快、灵敏度高、特异性强。LAMP反应在等温条件下很容易进行，一般在45～60 min内即可完成大量样品的检测，若增加一对环引物，检测时间可缩短到30～60 min，其反应灵敏度可达到PCR的10～100倍；其次，LAMP检测方法操作简单、无需昂贵的设备、可使用范围广。LAMP反应不需要昂贵的仪器，只要简单的水浴或加热即可。结果不需要放大处理，根据反应过程产生沉淀物的浊度，或利用钙黄绿素(Calcein)、羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue，HNB)、SYBR Green I等进行荧光检测，即可肉眼对结果进行直接观察。这使得LAMP检测可在实验室、室外现场检测,甚至是世界上资源有限的地区都能使用。

LAMP检测技术已成为目前病害诊断的主要方法之一，但在广泛使用的同时也应注意其不足：(1)LAMP检测时每个标靶都需要4～6个长度不等的引物，引物较多增加了正确设计难度的同时，使其相互之间作用的机会也更多，影响检测的准确性；(2)LAMP检测方法特异性强，使其无法用于研究已知信息较少的新基因或结构未知的目标基因；(3)不能用于扩增大于30 bp的序列，目的基因片段通常较短，反应产物是一系列大小不一的DNA片段，不能作为其他检测的材料，如PCR；(4)LAMP检测技术灵敏度高，样品制备、扩增和扩增后处理(如需要)必须在单独的空间进行，否则其极易被污染；(5)指示剂(钙黄绿素、HNB等)或其他反应组分(锰离子或反应辅助因子)浓度过高可能会抑制聚合酶反应，使产物分解或改变指示剂颜色，从而影响检测结果。

虽然LAMP技术目前仍存在一些缺陷，但其已成为目前诊断病害的重要方法之一，在农业、医学等领域得到了广泛的应用，同时LAMP技术也在不断的完善。许多新试剂的开发，如：Bst 2.0和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)、GspSSD 和Tin DNA 聚合酶和等温混合物(OptiGene Ltd,West Sussex,United Kingdom)等极大地提高了检测的热稳定性和扩增效率；LAMP-LFD(LAMP与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD) 结合，使结果可用肉眼直接观察)、IC-LAMP(免疫捕获与LAMP结合，省去了制备病原体DNA或RNA的步骤)等技术的开发，即保持了检测的有效性、灵敏度和特异性，同时减少了反应所需时间、更好的避免污染、对操作人员也更加安全；LAMP技术与带有特定光学标记特征的条形码结合，并对用于条码扫描的光学传感器进行计算机集成，或使用在与目标序列结合后可改变电或磁特性的纳米材料，实现了快速读取检测结果及检测结果的数字化管理。此外，为了使该技术可以应对大规模的筛查和对抗病毒病的大流行。研究人员提出了一种基于新型冠状病毒肺炎诊断的LAMP试纸条化检测方法，可供任何居家隔离或就诊困难的人群使用。再结合“improva”系统——集成了控制整个系统的中央单元、分离和纯化样品核酸的预处理单元、核酸序列检测和扩增的LAMP组件为一体，即可连接智能手机等电子设备，实现对检测结果和疾病发展情况的实时了解。虽然目前想要实现在日常生活的环境中进行恒温检测还较为困难,但随着越来越多的研究人员和实验室的加入，LAMP技术的完善性将不断提高，在未来得到更广泛的应用。