基于网络药理学的桑葚药理功能定位及作用机制分析

钟 雪，李 倩，宋 昱，王惠国，唐劲天

（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.清华大学工程物理系，北京 100084）

桑树（Morus alba L.）属桑科（Moraceae）桑属（Morus L.），果实桑葚每年4—6月份成熟，是一种药食两用的水果.桑葚中含有大量的维生素、氨基酸、有机酸、微量矿物质等营养物质，还含有白藜芦醇、花青素、多糖、萜类化合物、生物碱、挥发油类等化合物.研究[1-3]表明，桑葚具有抗肿瘤、保护肝脏、抗衰老、降血糖、降血压、增强免疫力、抗病毒以及抗炎等作用.Huang等[4]报道，桑葚能够在一定程度上通过诱导细胞凋亡抑制胃癌的增殖和生存；Ou等[5]研究发现，桑葚提取物可通过AMPK（AMP-activated protein kinase）途径减少脂质积累，抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化；Hsu等[6]研究发现，桑葚可通过降低脂质过氧化和抑制促炎基因的表达对CCL4诱导的肝损伤和纤维化起到保护和治疗作用.尽管桑葚有十分丰富的生物活性，但具体的药理作用及作用途径、靶点等尚不明确.

网络药理学的出现极大程度上否定了药物对应单一靶点、单一疾病的理论，尤其是中药组方.构建药物与药物、药物与靶点、药物与疾病的网络体系，在大数据的支持下解释药物作用于人体这个复杂的信号网络的机制，从宏观整体的角度预测药物多成分和多靶点、多通路的关系是当前药物研究与开发的热点[7].如王佳俊等[8]基于现代信息技术，分析了含黄连方剂治疗UC的配伍规律，并且在分子水平上揭示了含黄连核心药物组治疗UC的机制；秦晓宽等[9]通过文献数据挖掘并利用网络药理学的方法，探讨了高频组合中药治疗腰椎间盘突出症的潜在作用靶点及分子机制；Santbergen等[10]采用网络药理学方法，研究了芍药甘草汤治疗类风湿关节炎的作用机制.

本研究利用网络药理学方法，从文献数据库中搜集桑葚含有的化合物并加以筛选，对筛选出的有效化合物进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，寻找到最可能的药理作用和分子机制，为生物工业化生产、医药学研究和实验提供更好的方向和依据.

1 材料与方法

1.1 桑葚网络数据库构建

使用中国知网（https：//www.cnki.net/）、维普（http：//www.cqvip.com/）、万方数据知识服务平台（http：//www.wanfangdata.com.cn/index.html）、PubMed（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）等数据库，在所有发表的文献当中搜集桑葚内含有的化合物.

1.2 桑葚有效化合物的筛选

利用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和Pub-Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），对得到的所有化合物进行分析比对，去除重复化合物，并保存SDF或mol2格式的3D分子结构图.设置筛选条件：口服生物利用度≥30%（oral bioavailability，OB），类药性≥0.18（drug likeness，DL）.OB在评估药物和食品成分通过肠屏障的吸收和运输中至关重要[11]，类药性是依据药物的要求评价所查化合物与现有的已知药物的相似性.

1.3 桑葚有效化合物靶点及蛋白PPI网络构建与分析

通过STITCH version 6.0[12]（http：//stitch.embl.de/）、Swiss Target Prediction[13]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和UniProt[14]（https：//www.uniprot.org/）检索上述筛选到的潜在化合物，寻找到它们对应的靶点蛋白的Uniprot ID和ChEMBL ID，选择Probability*＞0.5、combined score＞0.5的蛋白，同时筛除重复的靶点蛋白并进行整理.利用String（https：//string-db.org/）和Cytoscape[15]软件进行蛋白的网络互作分析.

1.4 GO富集分析和KEGG通路注释分析

将整理好的靶点蛋白的信息用DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）进行富集分析[16].选择“Homo sapiens”，将置信度评分设置为≥0.4定义为显著，下载数据导入Excel表格，同时用R语言将得到的信息可视化.

1.5 靶点分子对接

将蛋白互作分析出的最具有可能性的蛋白输入PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库进行搜索，选择分辨率最好的蛋白晶体结构下载，得到编号为6BFJ.利用Schrodinger suite 2017软件对靶蛋白与小分子的相互作用方式进行对接研究[17].

2 结果与分析

2.1 桑葚中主要化合物的分析

通过搜集文献，得到桑葚中含有的所有化合物，去除重复，共得到64种化合物，包括芦丁、槲皮素、异槲皮素、二氢槲皮素、白藜芦醇、原儿茶素、矢车菊素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、花青素、花色苷、咖啡酸、黄芪苷、桑黄素、杨梅酮、山奈酚、天竺葵-3-O-芸香糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、DNJ、D-焦谷氨酸乙酯、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯、维生素C、维生素A、磺胺素、核黄素、尼克酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、麦芽糖、甘露糖、甲基庚烯酮、脯氨酸、鼠李糖、丝氨酸、组氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、甘露醇、天门冬氨酸、阿拉伯糖、丙氨酸、海藻糖、半乳甘露聚糖、半乳糖、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、长叶烯、天竺葵醛、月桂醛、癸醛、二十二烯、琥珀酸酐、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、己酸、2，4-二甲基己烷、2-甲基十三烷、丁香酚、正十六烷.这些化合物主要为单糖、氨基酸类、脂肪酸类、黄酮类、甾醇类、香豆素类、挥发油类、多酚类、花青素类等.

2.2 桑葚化合物-靶点网络构建与分析

根据OB≥30%、DL≥0.18的条件对64种化合物进行筛选，共得到5种具有生物活性的化合物，分别为二氢槲皮素、黄芩苷、桑黄素、杨梅酮和山奈酚，如表1所示.

表1 桑葚的5种活性成分Tab.1 Five active compounds in mulberry

2.3 有效化合物的靶点及蛋白PPI网络构建与分析

5种潜在化合物共有71个靶点蛋白，具体如表2所示.将71个靶点输入到String中进行网络互作研究，根据“degree”和“combined score”计算设置蛋白的颜色和大小，得到网络互作关系，即蛋白之间的生物相关性，结果如图1所示.由图1可知，去除游离的蛋白靶点（P＜1.0×10-16）后，一共得到71个节点240条边，平均节点度为6.76.将数据导入Cytoscape软件中，绘制出关键靶点的蛋白互作图.通过“degree”算法发现，caspase-3（degree=27）具有最高的节点数，caspase-3是caspase蛋白酶家族一员，是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶；其次是PTGS2（degree=26），PTGS2是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，也是一种重要的炎性介质，与细胞增殖和凋亡密切相关，降低PTGS2的活性可能会抑制肿瘤细胞增殖[18]；第3位基因是ESR1（degree=24），它位于6q25染色体上，是雌激素受体，主要生理作用是刺激促性腺激素分泌、调节卵泡生成等，有研究[19]表明ESR1的表达和突变与乳腺癌密切相关.

图1 蛋白网络互作Fig.1 Protein network interaction

表2 桑葚潜在作用靶点Tab.2 Information of potential targets from mulberry

2.4 靶点GO富集分析和KEGG通路分析

靶点蛋白的DAVID富集分析结果如图2所示.图2列出了含有基因数最多的前15条通路，Q值均小于0.05，数值越小表示相关越具有显著性.图中颜色代表-lgQ，颜色越红代表数值越高，说明与该通路相关性越高；点的大小表示含有基因数的多少，点越大对应的基因数目越多.由图2可以看出，桑葚中的化合物在代谢途径（metabolic pathways）这条通路含有基因数量最多，其次是癌症途径（pathways in cancer）、甾类激素生物合成途径（steroid hormone biosynthesis）、戊糖、葡萄糖醛酸转换途径（pentose and glucuronate interconversions）、化学致癌作用途径（chemical carcinogenesis）、癌症中的microRNAS（microRNAs in cancer）等.细胞成分主要集中在cytoplasm、membrane和cytoplasmic part.分子功能主要集中在binding、catalytic activity和ionbinding.这些极有可能是通过cellular process、metabolic process以及organic substance metabolic process等生物过程进行的.

图2 GO和KEGG富集通路分析Fig.2 Analysis of GO and KEGG enrichment pathways

2.5 靶点分子对接

将筛选到的5种化合物分别与caspase-3蛋白对接，结果发现黄芩苷具有最高的得分.黄芩苷与caspase-3蛋白的分子对接结果如图3所示.

图3 分子对接Fig.3 Molecular docking

由图3可以看出，黄芩苷可很好地进入caspase-3蛋白氨基酸残基形成的疏水口袋，表明其与caspase-3具有良好的亲和力.在作用方式上，由图3（a）可知，黄芩苷可与caspase-3蛋白中的Hie121、Ser120、Gln161、Thr166、Thr625个氨基酸残基形成氢键作用，与Ala162、Cys163、Trp206、Tyr204、Phe128以及Met61形成疏水作用，与Hie121形成ππ共轭作用（π-πstacking），与Arg64、Arg207以及Gln123形成静电作用.进一步印证了网络药理学网络互作的筛选结果.

3 讨论与结论

本研究应用网络药理学方法，对桑葚的成分、相关靶点分子功能、细胞组成、生物过程和KEGG通路进行富集分析，最后通过分子模拟及分子对接方法验证了化合物和靶点分子互作的可靠性.从已发表文献中共得到桑葚的64种化合物，根据OB≥30%、DL≥0.18的条件从中筛选出5种具有生物活性的化合物，分别为二氢槲皮素、黄芩苷、桑黄素、杨梅酮、山奈酚，它们对应了71个潜在的蛋白作用靶点.蛋白网络互作分析结果表明，caspase-3具有最高的节点数.这些靶点富集出67条通路，其中多数与癌症相关，包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌等.由富集分析结果可以推测，桑葚可能通过细胞凋亡、VEGF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路以及p53信号通路等影响肿瘤的发生和发展.此外，桑葚有可能对阿尔茨海默症、类风湿性关节炎、脂肪的消化与吸收、胆固醇代谢、病毒性心肌炎等一些疾病存在潜在的影响.

从桑葚中得到的5种有效化合物中，黄芩苷与caspase-3靶点蛋白结合的得分最高.Orzechowska等[19]研究发现，黄芩苷具有能够影响B-急性淋巴细胞白血病不同染色体重排的抗肿瘤作用.刘莎莎等[20]研究发现，黄芩苷能通过凋亡抑制食管癌的发生和发展.黄芩苷还具有抗炎[21]、抑菌[22]、降血糖[23]等作用.本研究结果表明，黄芩苷与caspase-3靶点蛋白的亲和力最好，可很好地进入caspase-3蛋白氨基酸残基形成的疏水口袋.caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分.

总的来看，根据蛋白功能预测分析，桑葚所含化合物与肿瘤治疗有很大的相关性，尤其是化合物黄芩苷，能够与靶点蛋白caspase-3很好地结合，后续还需进一步验证预测靶点的准确性.网络药理学作为一种新兴的科技手段，还存有一定的局限性，数据资源平台需要专人维护检修，数据库资源还需进一步的扩充和完备.本研究揭示了桑葚的多化合物、多靶点、多通路的生物学特点，整体上为研究其生物活性物质提供了新的方法和思路.