六味地黄丸治疗小儿脑瘫的疗效及其基于网络药理学的机制研究＊

赵任杰，王学明，陈芳民，岳昭娣，刘易博，于子夫，于少泓

（1.山东中医药大学康复医学院 济南 250300；2.临沂市中医医院 临沂 276003；3.山东中医药大学第二附属医院 济南 250001；4.山东中医药大学第二临床医学院 济南 250014）

小儿脑性瘫痪（pediatric cerebral palsy，PCP）即脑瘫，是一组持续存在的中枢性运动和姿势发育障碍、活动受限症候群,这种症候群是由于发育中的胎儿或婴幼儿脑部非进行性损伤所致[1]。PCP是儿童康复部门最常见的疾病，世界范围内发病率约为1.5‰-4‰，我国脑瘫的发病率为1.8‰-6‰[2]。据我国患病率统计，男性高于女性（2.25‰ VS 1.59‰），农村高于城市（2.75‰VS 1.90‰），不同地理区域的患病率存在显著差异，发生率有逐年增长的趋势[3]。国内外多采用物理治疗、作业治疗、言语治疗、感觉统合训练、心理治疗等康复疗法进行治疗，以促进患儿发育，增强自主活动能力，提高生活质量，然而存在治疗周期长、医疗成本大、单一康复训练临床疗效欠佳、无法修复神经系统损伤、大龄患儿疗效差等问题[4-6]；在我国，尚有针灸、推拿、穴位注射、中药等疗法，在改善运动功能、姿势控制、痉挛和平衡能力方面，中医取得了显著成效，但目前相比其他疗法，中药应用研究稍有欠缺[7-8]。PCP是世界性难题，当前仍缺乏针对此病的特效药，因此探索提升治愈率、降低致残率、缩短康复训练周期、减轻患儿家庭负担的药物至关重要。

PCP病变主要累及脑白质，患儿表现为发育迟滞、反应迟钝甚至无反应，智力低下，缺少表情变化，常因肌张力低下引起的肢体无力、自主运动缺乏，符合中医“五迟五软”肝肾亏损型的病理表现。古籍中记载，五迟证之行迟由先天禀赋不足、精血亏虚、骨失所养导致者，发迟由肾衰精血不足所致者，齿迟由肾虚精髓不充所致者，语迟禀父肾气不足者，坐迟因胎禀不足者与五软证中先天禀赋不足患儿，用方遣药多施以六味地黄丸，通过补益肾精填髓来达到治疗效果[9-10]；在临床PCP辨证分型研究中，肝肾亏损型被普遍认可，常采用六味地黄丸类方加减治疗。因此，临床研究时选择六味地黄丸进行干预，然而其作用机制尚不明确，在临床研究基础上，引入六味地黄丸的网络药理学分析方法[11]对作用机制进行揭示。

清华大学的李梢[12-13]等倡议使用网络药理学方法探索中药作用机制并制定了评价指南，网络药理学将传统化学药“一药一靶”的研究思路拓宽成“一药多靶”和“多成分—多靶标”的研究模式，以确定疾病相关基因的优先顺序，预测中药化和成分的靶点和药理作用，因此适合应对中药“多成分、多靶点、多途径”问题[14-15]。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2021年6月至2021年10月临沂市中医院收治的46例27个月至116个月肝肾亏损型PCP患儿为研究对象，通过医院伦理委员会审批（伦理审批号:LYSZYY20210005），采用随机数字表法将患儿分为对照组和药物组各23人：对照组男15例，女8例，月龄27-87月，平均58.96±13.78月；药物组组男13例，女10例，月龄38-116月，平均62.08±17.17月，月龄、性别无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 诊断标准

西医诊断标准参考为中国康复医学会儿童康复专业委员会与中国残疾人康复协会小儿脑性瘫痪康复专业委员会制定的《中国脑性瘫痪康复指南（2015）：第一部分》：①中枢性运动障碍持续存在婴幼儿脑发育早期(不成熟期)发生，涉及粗大运动与精细运动；②运动与姿势发育异常，涉及俯卧位、仰卧位、坐位和立位；③反射发育异常，出现病理反射阳性；④肌张力及肌力异常[1]。中医诊断标准参考全国高等中医药院校规划教材（第十版）《中医儿科学》五迟、五软肝肾亏损型的诊断标准：筋骨萎弱，发育迟缓，坐起、站立、行走、生齿等明显迟于正常同龄小儿，头项萎软，天柱骨倒，舌淡，苔少，脉沉细无力[16]。

1.3 纳入标准

①符合上述诊断标准；②年龄2-10岁，性别不限；③无其他基础病，可配合治疗；④患儿监护人签署知情同意书。

1.4 排除标准

①不符合上述诊断标准；②癫痫发作频繁影响治疗者；③合并其它重要脏器疾病、严重畸形、严重感染、恶性肿瘤者；④接受其它治疗，可能影响治疗结果评价者；⑤出现严重不良反应者。

1.5 治疗方法

对照组采用常规儿童康复治疗，包括物理治疗、作业治疗、言语治疗、感觉统合训练。①物理治疗：通过功能训练促进与改善运动功能，建立正确的运动模式，选择神经发育学疗法、Bobath治疗技术与Vojta治疗技术手法治疗；②作业治疗：增加关节活动范围，侧重改善精细运动功能，提高患儿生活自理能力；③言语治疗：促进言语功能发育，进行构音训练，改善患儿舌、唇、下颌功能；④感觉统合训练：增加感觉输入，促进患儿大脑整合感觉信息，诱发主动运动，改善运动、平衡、协调功能。根据患儿康复评定选择适当疗法，1次/天，30 min/次。药物组在常规康复治疗基础上给予六味地黄丸（九芝堂股份有限公司，国药准字Z43020145）加减治疗，20kg以下患儿每次4丸，20-40 kg患儿每次6丸，40 kg以上患儿每次8丸[17]，若患儿无法吞服用温水溶解后饮用，3次/天，两组均连续治疗4周。

1.6 观察指标

粗大运动功能以《中国脑性瘫痪康复指南（2015）》推荐的（GMFM）量表为评定标准，对A区卧位与翻身共17项、B区坐位共20项、C区爬和跪共14项、D区站立位共13项与E区行走跑跳共24项五个能区进行判定。

1.7 统计学方法

使用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行数据处理，计量资料使用t检验，计数资料使用卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.8 典型病例

王某，女，5岁余（65月龄），因行走不稳，追视差，面部特殊面容，表情欠丰富入院，该患儿一般情况尚可，无发热，无咳嗽，无腹泻，无呕吐，无四肢抽搐，夜间睡眠尚可，大小便未见明显异常。中医四诊发现瘦弱行迟，易受惊吓，头发稀疏，舌淡红苔剥，脉沉细，属于典型肾阴亏虚体质。经患儿监护人同意，给予六味地黄丸治疗，服用4周后复查，上诉诸证改善，GMFM评分中站立位13项与行走、跑、跳24项评分由30提高至66。

1.9 六味地黄丸有效成分和靶点基因收集

运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/index.php）数据库分别检索六味地黄丸各成分，根据ADME参数选择口服生物利用度（OB，Oral bioavailability）≥30%、药物相似性（DL，Drug-likeness）≥0.18对六味药逐一进行筛选，结果汇总后运用Uniprot数据库（https://ebi14.uniprot.org/）将靶点蛋白名称转换成基因名称。

1.10 构建六味地黄丸-成分-靶点网络

使用Excel软件准备网络和属性文件，完成后分别导入Cytoscape3.7.2软件构建六味地黄丸-成分-靶点网络，将中药设置为圆形，药物成分设置为正八边形，基因设置为菱形，各药成分以中药为圆心呈圆形分布左右，共有成分分布下方，基因呈矩形分布中央，根据网络Degree值设置节点大小。

1.11 PCP相关靶点基因收集

在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中检索关键词“pediatric cerebral palsy”获取与小儿脑性瘫痪有关的靶点基因，汇总后运用Uniprot数据库（https://ebi14.uniprot.org/）选择物种人类（Human）转换成已验证（Reviewed）的Uniprot KB。

1.12 构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络

将六味地黄丸和PCP的靶点分别去重后使用VENNY2.1平 台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制韦恩图，交集部分为共有靶点，上传至STRING数据库（https://string-db.org/）构建网络，物种选择智人（Homo sapiens），蛋白最低相互作用阈值设置为最高可信度（highest confidence）0.700，并选择隐藏网络游离节点。

1.13 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将交集靶点上传至DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），物种选择智人（Homo sapiens）进行富集分析后运用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）将结果制作成图片。

1.14 构建靶点-通路网络

富集分析结果使用Excel软件制成网络和属性文件，导入Cytoscape 3.7.2软件构建靶点-通路网络，通路设置为蓝色倒三角形，呈圆形分布外周，靶点设置为绿色椭圆形，呈矩形分布中央。

2 疗效标准与结果

2.1 疗效标准

参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》制定[18]。显效：患儿肌张力下降，异常姿势基本消失，关节活动功能无明显异常。有效：患儿显著好转，异常姿势、关节活动功能有改善。无效：患儿肌张力、异常姿势、关节活动功能等均无明显变化。总有效率=（显效例数+有效例数）/总例数×100%。

2.2 月龄、性别对比

对照组与药物组月龄与性别差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 患儿一般情况对照

2.3 治疗前后粗大运动功能比较

治疗后两组评分显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；且六味地黄丸药物组明显优于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 治疗前后GMFM评分对照

2.4 两组临床疗效比较

治疗4周后，药物组总有效率高于对照组，两组临床疗效总有效率比较，差异有统计学意义（表3）。

表3 临床疗效比较（例（%））

2.5 六味地黄丸有效成分和靶点基因

通过检索与ADME筛选共获得六味地黄丸有效成分47个，其中熟地黄2个，山茱萸14个，牡丹皮6个，山药12个，茯苓6个，泽泻7个，有效成分信息见表4。47个有效成分收集到557个对应的靶点蛋白，运用Uniprot数据库转换成标准化的基因名。

表4 六味地黄丸有效成分信息

续表

2.6 靶点-通路网络

图1包含385条边，84个节点，其中通路20个，靶点基因节点64个。

图1 靶点-通路网络

2.7 PCP靶点基因

在GeneCards数据库中检索得到与PCP相关靶点基因1696个，根据相关性评分（Relevance score）中位数筛选得到靶点基因849个。

2.8 韦恩图及PPI网络

使用VENNY2.1平台将557个药物靶点基因和849个疾病靶点基因绘制成韦恩图（图2），A为六味地黄丸靶点基因，B为PCP靶点基因，交集靶点99个。PPI网络（图3）共有99个节点，836条边，网络中degree值排名前十的靶点基因依次为TP53、AKT1、JUN、TNF、MAPK1、IL6、HSP90AA1、RELA、MAPK8、VEGFA。

图2 六味地黄丸与小儿脑性瘫痪靶点韦恩图

图3 PPI网络图

2.9 GO和KEGG富集分析

对交集靶点进行GO和KEGG分析，结果分别绘制得GO富集分析图（图4）和KEGG富集分析图（图5），GO柱状图中横轴为条目名称，纵轴为基因数目，GO富集结果显示生物学过程（BP，Biological process）主要涉及positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、response to drug、negative regulation of apoptotic process、positive regulation of gene expression、positive regulation of transcription,DNA-templated、signal transduction；细 胞 组 分（CC，Cellular component）主 要 涉 及nucleus、cytosol、cytoplasm、plasma membrane)、extracellular space、nucleoplasm；分子功能（MF，Molecular function）主要涉及protein binding、enzyme binding、protein homodimerization activity、DNA binding、transcription factor binding。KEGG气泡图中横轴为富集倍数，纵轴为通路名称，KEGG通路富集结果显示六味地黄丸治疗PCP涉及癌症通路（Pathways in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HTLV-I感染通路（HTLV-I infection）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）等。

图4 GO柱状图

图5 KEGG气泡图

2.10 六味地黄丸-成分-靶点网络

如图6所示，网络节点共259个，604条边，其中绿色圆形药物节点6个，使用药物名称拼音大写首字母标记，如熟地黄标记为DH；彩色正八边形药物特有成分节点40个，使用药物名称拼音大写首字母加数字编号标记，如牡丹皮成分一标记为MDP1；红色正六边形共有成分节点2个，使用A1、B1标记；蓝色菱形基因节点211个，显示作用关系的边共604条。节点依照Degree值设置透明度与大小，呈正相关：Degree值越大，透明度越高，节点越大。排名靠前的基因有：NCOA2、PTGS2、PGR、NR3C2与PTGS1，这五个靶点对应的化合物最多，直接作用的边分别为24条、18条、18条、15条与15条；排名前五的药物化学成分有：以MDP5标记的槲皮素（quercetin）、以B1标记的豆甾醇（Stigmasterol）、以MDP2标记的山奈酚（kaempferol）、以SZY6标记的β-谷甾醇（beta-sitosterol）、以SZY11标记的四氢鸭脚木碱（Tetrahydroalstonine）五种化合物调控的靶点最多，直接作用的边分别为152条、96条、61条、38条、27条。

图6 六味地黄丸“中药-成分-靶点”网络图

3 讨论

六味地黄丸系宋代儿科大家钱乙将张仲景名方肾气丸化裁制成，方中熟地黄为君，味厚能益肾水，可以滋阴补血，益肾填精，用量八钱最多；水弱土胜，湿邪困肾，需用三钱佐药泽泻泄出；木需水生，可以制约土，四钱山萸肉味酸直入肝经助木为臣，不再消耗已经亏虚的肾水，并且能制约脾土乘肾水；三钱佐药牡丹皮清相火，加强山萸肉助木作用；四钱山药补阴生津兼固精为臣，佐三钱茯苓渗湿健脾。六药合用，三补三泻，方中三味补药与三味泻药用量比为16:9，全方长于补益肾阴[19]。古今临床发现此药对肝肾阴虚引起的各种病证均有良好治疗作用，可通过填精补髓、滋肾益脑的作用来治疗肝肾阴虚型PCP。赵彩娇[20]等采用六味地黄丸联合针刺与推拿疗效显著，4例治愈；李欢等[21]应用六味地黄丸联合补中益气汤药浴取得了良好疗效。本研究发现，在常规康复治疗基础上施加六味地黄丸治疗，药物组显效9例，有效13例，总有效率为95.65%。

运用网络药理学方法筛选得到槲皮素、豆甾醇、山奈酚、β-谷甾醇等关键成分。Vig Rajat等[22]研究发现，槲皮素具有乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性、抗氧化活性与抗痴呆样活性，通过AChE介导的机制治疗实验小鼠的学习记忆障碍，能够调节认知缺陷，改善胆碱能通路异常信号传递，致使AChE活性改变并恢复海马细胞结构。熟地黄、山茱萸和山药3味起补益作用中药的核心成分为豆甾醇，具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化活性，可降低胆固醇、参与神经保护。氧化可导致神经元死亡，豆甾醇能维持细胞内ROS水平并防止氧化应激诱导的细胞凋亡，促进受损细胞恢复活力，从而缓解氧化应激引起的神经变性[23]。山奈酚也具有神经保护作用，可以改善慢性脑缺血大鼠受损神经元被破坏的结构，通过提升模型大鼠脑组织抗氧化能力，来改善中枢神经系统主导的认知功能和肌肉骨骼系统主导的运动功能[24]。β-谷甾醇和豆甾醇活性强度相似，大脑神经生长因子（NGF）支持神经元的存活、分化与维持，是改善认知功能的关键，β-谷甾醇通过增强NGF活性促进神经突生长；乙酰胆碱是一种神经递质，由磷脂酰胆碱合成，可帮助传递信息，与大脑记忆功能密切相关，Koga等[25]认为，缺乏磷脂酰胆碱会诱导神经细胞（尤其是PC12细胞）凋亡，β-谷甾具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，发挥减少乙酰胆碱降解作用，起到改善记忆力的作用。

六味地黄丸可能通过TP53、AKT1、JUN等关键靶点治疗PCP，细胞肿瘤抗原P53（TP53）参与中枢调控，促进受损中枢系统神经轴突再生、萌发与功能修复[26]。苏氨酸-蛋白激酶1（AKT1）在人体内广泛存在，通过调节纤维状肌动蛋白动力学来促进轴突生长，在突触传递、记忆和精神病中发挥重要作用[27]。转录因子AP-1（JUN）与转录激活相关，可直接与特定的目标DNA发生特殊反应，能调控基因表达，在神经元凋亡和炎症中发挥重要作用。具有调控胶质细胞发育，促进神经元轴突成功再生功能，JUN缺陷小鼠表现为面部神经元轴突再生功能受损。一般脑缺血后可被高度激活，在大脑皮层的表达水平显著升高，有助于改善脑外伤、新生儿脑病、癫痫、中风、神经退行性疾病[28]。

六味地黄丸治疗PCP的靶点经GO富集分析得到558个条目，KEGG富集分析得到99个条目，前20个核心通路中涉及的信号通路有：PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路。PI3K-Akt信号通路可被上游信号激活，能调控细胞存活、凋亡、增殖和代谢，体内体外研究均发现这一通路在神经元细胞衰老和凋亡过程中发挥重要作用。激活后对因缺血致使受损的神经具有保护作用，并能抑制神经元细胞凋亡[29]。TNF信号通路主要由肿瘤坏死因子（TNF）发挥作用，TNF参与全身炎症，机体衰老、损伤或退行性神经系统疾病会诱发TNF-α的产生和释放，它与体内特定受体结合时会引起毒性生物效应，造成对机体的破坏。HIF-1信号通路共有109个作用基因，由缺氧诱导因子（HIF）介导，激活后增加细胞能量代谢以帮助哺乳动物适应缺氧环境。HIF调节能量代谢、血管生成和细胞凋亡，缺氧时激活可促进内皮细胞增殖粘附形成血管，有助于减轻脑部缺血缺氧造成的神经损伤[30]。综上所述，关键作用靶点和关键通路与神经元可塑性、神经损伤后建立新连接、神经保护作用有关，可对PCP起到调节与治疗作用。

经由临床研究发现，相较常规康复治疗，康复训练基础上使用六味地黄丸治疗肝肾阴虚型PCP患儿疗效更佳；实验研究发现，六味地黄丸治疗组大鼠脑组织中多巴胺（DA）与去甲肾上腺素（NE）含量显著增高，优于常规康复训练组；六味地黄丸对脑瘫模型大鼠脑组织神经递质影响的实验研究发现，六味地黄丸具有改变大鼠体内乙酰胆碱酯酶（AchE）含量的作用，中药治疗组含量改变明显，运动功能评定亦显著改善（P＜0.05）[31-32]。本文以临床为基础，借助网络药理学探讨六味地黄丸治疗PCP疗效显著的作用机制，分析研究流程符合《网络药理学评价方法指南》要求，具有可靠性、规范性与合理性，为临床应用中药防治PCP提供了案例与理论依据。然而由于网络药理学方法的局限性，TCMSP数据库筛选可能会产生偏差，下一步拟对预测结果进行深入研究，探讨产生疗效的详细机制，以期为临床应用提供更多基因、细胞水平的理论依据。