基于代谢组学探讨电针对WKY抑郁大鼠的抗抑郁作用＊

李 翔，曾晓铃，顾政平，李珊珊，徐世芬＊＊，李 蔚

（1.上海中医药大学附属市中医医院 上海 200071；2.上海交通大学医学院学术部 上海 200030；3.复旦大学基础医学院 上海 200231）

抑郁症（Depression）是一种多因素导致的精神障碍，主要特征是情绪忧郁、缺乏兴趣和动力[1]。世界卫生组织认为抑郁症是社会中负担最重的疾病，它可能成为全球高致残率的主要诱因之一[2-3]，在我国抑郁症患病率在逐年上升，但有将近一半以上的患者未接受任何治疗。目前对于抑郁症的机制研究主要集中在神经递质的减少[4]，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴改变[5]，免疫功能异常[6]及神经可塑性[7]等。然而现有的治疗抑郁症的药物不能有效的改善抑郁症状，针灸作为一种安全绿色的治疗方法，已经被证实能够有效的改善抑郁患者的症状[8-9]。因此，进一步了解针灸治疗抑郁症的作用机制可以为抑郁症的预方和治疗提供新的思路与方向。

随着对抑郁症的研究深入，通过蛋白组学、基因组学和代谢组学等组学方式揭示抑郁症的发病机制被广泛接受。代谢组学是通过分析比较机体内代谢物在不同病理生理状态下的变化[10]，代表着生物体对内部和外部刺激的最终反应。目前，代谢组学广泛用于电针治疗各种疾病的研究中，路思宇[11]等人利用代谢组学研究电针对脑梗死大鼠的尿液代谢的影响，陈平[12]等运用代谢组学研究电针对类风湿关节炎动物模型内源代谢物的影响，新昕[13]等人通过血清代谢组学研究电针对消化不良大鼠模型的影响，因此，代谢组学特别有利于识别病理生理影响的过程，为疾病的发生提供重要的证据，能够寻找出对疾病起着决定作用的生物标志物。

目前的研究已经表明，抑郁症的发生和代谢产物的变化有关[14-16]。针刺是在整体观念的指导下对机体产生一系列的反应从而达到治疗的效果。但是否能够通过调节代谢产物，影响相关代谢通路起到改善抑郁行为需要进一步研究。基于此，本研究将在证实电针能够改善WKY抑郁大鼠抑郁样行为的基础上，进一步采用代谢组学的研究方法，探究电针是否能够引起代谢产物变化，影响相关代谢通路，从代谢组学的方向评估针刺的抗抑郁作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

NewClassic MS电子天平（METTLER TOLEDO）；冷冻离心机（Eppendorf）；控温超声波清洗机-10L（宁波新芝生物科技股份有限公司）；多样品冷冻研磨仪（上海万柏生物科技有限公司）；台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）；氮气吹扫仪（上海净信实业发展有限公司）；液相色谱系统（AB SCIEX）；质谱仪（AB SCIEX）；华佗电针治疗仪（苏州医疗用品有限公司）；针灸针（无锡佳健医疗器械股份有限公司），行为学示踪系统（上海欣软科技有限公司）。

1.2 动物

SPF级雄性Wistar大鼠和Wistar-Kyoto（WKY）雄性大鼠，6周龄左右，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物进入动物房后均需经过一周的适应，期间自由摄食和饮水，然后再开始进行试验。动物房室温维持在22℃-27℃，湿度为40%-60%，噪音控制在50 dB以下，每天接受昼夜节律的光照。本次实验中的所有动物实验均是按照《上海中医药大学实验动物准则和使用规范》及动物伦理实验要求开展的。

1.3 动物分组及代谢样本收集

24只WKY大鼠随机分为模型组、电针组和假针组，8只Wistar大鼠作为对照组。电针组：抑郁模型大鼠进行电针干预。取穴：百会、足三里，参照《实验动物针灸穴位图谱》。操作方法：百会向前斜刺5 mm，足三里直刺3 mm，华佗电针仪，将正极连接于百会上，负极连接足三里，足三里单侧交替进行连接，连续波，频率2 Hz，电流根据大鼠头部出现颤动并且不嘶叫为度，留针15 min，连续治疗3周。为避免因动物捆绑而引起的应激反应而干扰实验结果，大鼠在电针过程中被置于特制的塑料鼠笼中，使得大鼠有一定的活动空间。假电针组：抑郁模型大鼠进行假电针干预。采用同电针组同样的抓取，将同样的针灸针分别用胶带固定于百会、足三里体表，并给予电极连接，但无电流，干预时间同电针组。电针干预结束收集对照组、模型组和电针组大鼠的粪便样品，假针刺组不收集。

1.4 行为学测试

1.4.1 旷场实验

旷场场地为一个50 cm×50 cm×40 cm的正方形区域。每次实验将一只实验大鼠置于旷场中，通过旷场实验平台软件记录大鼠5min内的运动情况。在进行下一只实验前，用75%酒精擦拭旷场，待旷场充分干燥后放入大鼠。旷场底部被平分为9个区域，其中心为中央区域。大鼠在中央区的运动路程总和为中央距离，在旷场内前肢离地，后肢着地为直立状态并记录次数。旷场中的运动总路程为总距离将用来评估大鼠的运动能力。旷场实验数据采集系统使用上海欣软平台进行记录与分析。

1.4.2 强迫游泳

往高45 cm、直径18 cm的玻璃圆筒中倒入24℃-28℃的水，水深度30 cm。将大鼠置于圆筒中，通过软件计时，记录5 min内大鼠的不动时间。

1.4.3 新奇抑制摄食

实验场地为长50 cm、高40 cm的正方形敞箱，在箱底中央固定一食盒，在盒中放入数块糖丸。试验开始前，动物禁食48 h，试验时从任意位置将大鼠入敞箱中，通过摄像采集系统观察5 min，记录大鼠的活动量和放入大鼠到大鼠前肢抱起糖丸进食的潜伏时长。

1.5 代谢数据采集与处理

样本制备：从-80℃冰箱中取出粪便样品，使用电子天平精确称取粪便样品50 mg然后移至2 mL的离心管中，加入直径6 mm的研磨珠研磨，往离心管内加入含0.02 mg·mL-1L-2-氯苯丙氨酸的提取液400µL，将样品置于冷冻组织研磨仪研磨6 min，在4℃，40 KHz的低温超声中提取30 min，将上述结束的样品于-20℃的条件静置30 min，然后在4℃，13000 g的离心机中离心15 min，取上清液待上机分析，另外每个样本各取20µL的上清液，混合均匀后作为质控样本。

LC-MS分析液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d,1.8 µm;Waters,Milford,USA）；流动相A：95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流动相B：47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水（含0.1%甲酸）；流速为0.40 mL·min-1，进样量为10 µL，柱温为40℃。

质谱条件：采用正、负离子模式采集质谱信号，检测参数：正、负离子模式下离子源电压分别为5000 V和4000 V，气帘气、喷雾气和辅助加热气分别为30、50 psi和50 psi，质量扫描范围m/z 50-1000，去簇电压：80 V，离子源温度为550℃。

代谢数据处理：将采集所得的LC-MS数据原始文件导入ProgenesisQI（WatersCorporation，Milford,USA）进行数据处理，最终得到含保留时间、质荷比和峰强度等信息的数据矩阵。将所得的数据进行归一化处理后可用于筛选差异表达的代谢物。将筛选出的差异代谢物和数据库进行注释比对，可以获得对应的代谢通路的代谢物集，通过Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca）进行通路富集分析并利用KEGG在线数据库对差异代谢物所涉及的相关代谢通路进行分析。数据分析操作主要在美吉生信云平台上完成。

1.6 统计分析

动物行为学检测数据采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析，实验数据采用Mean±SD表示，符合正态分布及方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布则采用非参数检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学检测结果

2.1.1 旷场实验

与对照组相比，模型组在旷场试验中的直立次数更少（P＜0.001），中央运动距离减少（P＜0.05）；与假针组相比，电针组在旷场试验中的直立次数增加（P＜0.001），中央运动距离增加（P＜0.05），差异有统计学意义。四组在旷场试验中的总运动距离没有统计学差异，但是相较于对照组，模型组的总运动距离降低，相较于假针组，电针组总运动距离增加，结果如图1所示。

图1 旷场实验的总距离（A）、直立次数(B)和中央距离(C)

2.1.2 强迫游泳

在强迫游泳中，与对照组相比，模型组大鼠不动时间延长（P＜0.001），与假针组相比，电针组在强迫游泳的不动时间缩短（P＜0.001），结果如图2所示。

2.1.3 新奇抑制摄食

在新奇抑制摄食试验中,与对照组相比，模型组的潜伏摄食时间增加（P＜0.001）。与假针组相比，电针组的潜在摄食时间减少（P＜0.001）。结果如图2所示。

图2 强迫游泳（A）和新奇抑制摄食（B）

2.2 WKY大鼠代谢物质变化

2.2.1 样本多元统计分析

对电针组、模型组及对照组大鼠的粪便进行了质谱检测，然后采用PCA（主成分分析）和PLS-DA（偏最小二乘判别分析）统计方法对结果进行识别分析。采用PCA方法对所有样本的数据进行分析，结果见图3。在正离子和负离子模式下，对照组和模型组均沿PC2轴分开，表明对照组与模型组主成分不同。电针组与对照组、模型组距离均较远，说明电针的作用在代谢过程中对各组样本粪便的代谢物组成的影响比较显著。在利用PLS-DA分析时，结果如图4所见，对照组、模型组和电针组在正离子和负离子模式下都能明显的区分开来。说明三组之间具有明显的组间差异，代谢产物具有差异。因此，无论是正离子模式还是负离子模式，PCA与PLS-DA方法能很好的区分各组之间表达差异明显的代谢物。

图3 PCA分析：正离子模式（A）和负离子模式（B）

图4 PLS-DA分析：正离子（A）和负离子（B）

2.2.2 差异代谢物的筛选

为了分析对照组和模型组、模型组和电针组中存在显著性差异的代谢物，将OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）分析参数VIP＞2且单变量统计分析参数P＜0.05的代谢物作为显著性差异代谢物。如图5所示，在前30位显著差异代谢物中，三组共同变化的代谢产物有7种，分别是甜菜苷、环己基氨基磺酸酯、10-氢过氧-H4-神经前列腺素、15(S)-羟基二十碳三烯酸、地奥司明、2，6-壬烷-1-醇、9-氧代壬酸。其中甜菜苷在模型组中升高，在电针组中降低；环己基氨基磺酸酯、10-氢过氧-H4-神经前列腺素、15(S)-羟基二十碳三烯酸、地奥司明在模型组中降低，在电针组中升高。

图5 对照组与模型组、模型组和电针组差异代谢物分析

2.2.3 差异代谢通路分析

将得到的显著性差异代谢物提交至KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）网站用于分析可能参与的代谢途径。如图6所示，代谢产物参与的与人类有机系统的通路有3条，主要是消化系统、神经系统和内分泌系统；代谢相关的生物过程有9条通路，主要是脂质代谢、氨基酸代谢和生物素降解与代谢等途径;疾病相关的网络有3条通路，分别为肿瘤疾病、免疫疾病和感染性疾病。

图6 差异代谢物的KEGG通路分析

3 讨论

本研究通过测定强迫游泳、新奇抑制摄食和旷场实验行为学改变等指标，评价WKY抑郁大鼠的抑郁状态。其中强迫游泳不动时间反映大鼠的绝望状态，被广泛用于评估抑郁大鼠的抑郁样行为；新奇抑制摄食潜伏时长反映大鼠对食物的欣快感；旷场实验行为则通常用于评估大鼠在新异环境中的自主和探究行为。上述行为学检测都能作为评估抑郁模型成功与否的标准。我们的实验结果表明，相较于正常对照组，模型组大鼠直立次数减少，中央距离减少；强迫游泳不动时间延长；新奇抑制摄食潜伏时间增加，证实了WKY大鼠存在抑郁行为。通过3周电针干预后，电针组的直立次数增加，中央距离增加；强迫游泳不动时间减少；新奇抑制摄食潜伏时间减少。研究结果表明WKY大鼠可作为可靠的抑郁症模型进行实验研究，同时电针可以有效改善WKY大鼠的抑郁样行为。

临床研究中，电针治疗抑郁症被证实有效的。胡建芳[17]等人通过中药联合针刺百会、四神聪、足三里等穴治疗脑卒中后抑郁，在治疗4周后发现患者的汉密尔顿抑郁量表及卒中量表评分降低，脑卒中生存质量量表评分升高；黄娟[18]等在通过针刺百会、神门、太冲、足三里等穴配合音乐疗法治疗老年性抑郁患者的疗效观察中证明，持续治疗6个疗程后有效率达96.67%；肖彬[19]等人在一项观察针灸配合耳穴治疗乳腺癌继发抑郁的临床研究中发现，针灸合谷、太冲、百会、足三里、气海等穴治疗有效率为86.7%，明显高于对照组;于海英[20]等人在研究电针治疗首发抑郁的临床观察中发现，与药物组相比，针药组的汉密尔顿抑郁量表总分和各因子得分均有统计学差异，电针可有效改善首发抑郁症的临床症状群。综上，电针治疗抑郁症临床疗效显著，我们的研究能为临床提供新的治疗方向。

代谢组学的研究思路与中医思维的整体观念是相似的，对认识疾病的发病过程，指导疾病的治疗都有重要意义，也为疾病的研究开拓了的方法[21-22]。研究表明代谢组学技术的模式识别分析（PCA、PLS-DA）指标灵敏性较其它的技术明显提高[23]，许多动物的行为学和形态学，甚至有限的生化指标不能表现出差别时，通过运用代谢组学方法既可以将其有效分类，又能够寻找到与分类有关的特征性差异标志物。通过代谢组学的方法，我们寻找到对照组与模型组存在115种差异代谢物，模型组与电针组存在59种差异代谢物。通过对差异代谢物所参与的KEGG通路分析发现，差异代谢产物主要参与了脂质代谢、氨基酸代谢和生物素降解与代谢等途径，进一步说明电针干预后，抑郁大鼠的代谢产物发生了改变，影响了脂质代谢、氨基酸代谢和生物素降解与代谢等代谢途径。

脂质代谢是脂类物质在体内合成、消化与转运的过程。脂质代谢异常与很多疾病有关，比如阿尔兹海默症[24]、高血压脑病[25]、骨关节炎[26]、抑郁症[27]等。脑内存在很多特殊的脂类可以直接参与抑郁症发病的过程。脂质代谢失调会影响很多递质传递系统，其中和抑郁症相关的主要包括磷脂代谢通路和大麻素信号通路[28]。有研究表明，脂肪酸及一些代谢物能在脑内特定的区域内发挥作用，调节许多过程，如神经传递和信号通路，最终影响抑郁行为[29]，n-3多不饱和脂肪酸、甘油三酯和甘油磷脂等脂质的异常可以诱导焦虑和抑郁相关行为[30]。长期食用高脂肪饮食会导致非人类灵长类动物后代的血清素系统紊乱导致焦虑和抑郁样行为增加[31]。

氨基酸代谢紊乱在抑郁症中已有相关的研究进展，刘史佳[32]等基于抑郁患者的血清代谢组学研究发现，抑郁患者血清中的苯丙氨酸、色氨酸等代谢产物发生显著变化，吕梦等[33]运用核磁共振氢谱代谢组学技术研究慢性温和不可预知应激抑郁大鼠粪便样本，共筛选出10种与抑郁相关的差异氨基酸代谢物，主要涉及丙氨酸代谢、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等氨基酸代谢途径。徐雪娇等[34]基于血清代谢组学技术探究电针对慢性应激抑郁大鼠代谢产物的影响，发现电针组的苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等6种氨基酸发生变化，主要涉及相对应的氨基酸代谢途径的改变。刘晓节等[35]通过代谢组学研究发现了抑郁症的发病可能与能量代谢、氨基酸代谢和神经递质合成有关。张洪财[36]等利用代谢组学技术，探究中药对抑郁模型血清代谢产物的影响，发现抑郁模型大鼠中的色氨酸、尿酸、胆酸等代谢产物显著变化，可能是调控了氧化应激、脂类代谢及氨基酸代谢发挥抗抑郁作用。

中医认为，从阴阳属性划分，抑郁症属于阴症，阴病治阳。《灵枢·海论》中有“髓海不足，则脑转耳鸣……”的描述，说明督脉的病症主要为脑病，脑病可选择督脉穴位治疗。《奇经八脉考》明确指出：“督脉……为阳脉之总督，故曰阳脉之海。”百会为督脉之穴，居颠顶部，督脉为一身阳脉之总督，主一身之阳，是“精髓升降之道路”，为健脑宁心，解郁安神之要穴。《素问·六元正纪大论》中有五气之木郁、火郁、土郁、金郁、水郁；《景岳全书》有怒郁、思郁、忧郁、惊郁、悲郁、恐郁等情郁。目前也有研究提出“气郁体质与抑郁状态存在相关性”[37]及“脾胃功能障碍导致的气机失调是抑郁症的主要病机”[38]。因此治疗抑郁症疏肝健脾和胃也至关重要。针灸常选择太冲、足三里等穴位配合治疗。足三里为足阳明经之合穴，足阳明经亦为多气多血之经脉，阳明经与督脉在头部交汇，百会配合足三里可以起到整体调节作用。体现了“调督安神”的治疗原则。本课题组长期应用于临床抑郁症的治疗中[39-41]，可以有效的缓解患者的主症，改善胃肠不适、焦虑和睡眠障碍等问题。

综上，本研究通过WKY抑郁大鼠模型，证实了电针能明显改善抑郁样行为。同时，利用非靶向代谢组学的方法探究了与抑郁症相关的代谢产物，发现电针后出现显著变化的差异代谢产物主要涉及脂质代谢、氨基酸代谢和生物素降解与代谢等代谢途径。初步揭示了电针的抗抑郁作用，为针灸治疗抑郁症提供了新的研究方向，后续可以通过更加精确的定量代谢组学方法进一步探究相关代谢通路中的差异代谢物的变化，从而找到电针作用的具体靶点，发现新的作用机制。