高脂饮食结合VCD药物诱导围绝经期肥胖小鼠模型的研究＊

李珊珊，李 翔，柯碧莲，陈颖棋，曾晓铃，岳虹妤，孙漫沁，徐世芬，宓轶群＊＊

（1.上海中医药大学附属市中医医院 上海200071；2.上海交通大学附属第一人民医院 上海200080；3.上海中医药大学针灸推拿学院 上海201203）

围绝经期（perimenopausal）是女性由生育期向绝经期过度的生理性阶段[1]。该阶段卵巢功能逐渐衰退，引起女性体内雌激素水平变化，主要表现为血清雌激素水平（Estrogen，E2）下降和促卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）水平升高[2-3]，引发一系列临床表现如肥胖[4-5]、血脂异常[6]、骨质疏松[7-8]、心血管疾病[9]、焦虑抑郁[10]以及代谢综合征[11]等问题，极大地影响围绝经期女性的身心健康和生活质量。研究表明，进入围绝经期后，不仅容易发生围绝经期肥胖，围绝经期肥胖又可以反过来影响围绝经期阶段的时间长短、症状的轻重等，两者相互作用相互影响[5]。避免围绝经期肥胖的发生可以有效降低围绝经期心血管疾病、妇科癌症等相关疾病的发生率，是临床中亟待解决的重要问题，也对围绝经期肥胖女性有着重要指导意义。

针灸作为祖国医学的一个重要分支，在治疗围绝经期肥胖方面具有显著的疗效和优势[12-14]，课题组前期临床研究发现，针刺可以改善围绝经期睡眠障碍[15]、缓解围绝经期潮热[16]。最近，在前期基础上发现通过穴位埋线能够有效帮助围绝经期肥胖患者减轻体重，并改善围绝经期综合征。但具体针刺或埋线是如何起到减肥作用的尚不清楚，国内外对围绝经期肥胖的研究也较少见。故课题组拟开展电针治疗围绝经期肥胖的机制研究，然而查阅相关资料发现关于围绝经期的机制研究大多为围绝经期血脂异常、围绝经期抑郁等，故有必要开展电针治疗围绝经期肥胖的相关机制研究，而稳定成熟的围绝经期肥胖动物模型是探索电针治疗围绝经期肥胖的重要基础。

近年来，关于围绝经期动物模型主要包括自然衰老模型、卵巢摘除模型、药物诱导模型等[17-20]，然而自然衰老模型周期过长，卵巢摘除模型不符合生理性绝经特点等诸多问题[20]。研究表明采用4-乙烯基环己烯二环氧化物（4-Vinylcyclohexene Diepoxide，VCD）药物可以靶向诱导卵巢损伤，不损伤其他器官，可以模拟围绝经期的状态[21-23]，但在中医药领域的相关研究中，尚未得到有效的应用。课题组前期研究发现，通过高脂饮食诱导，可以引起雌性小鼠体质量明显增加，通过VCD诱导可以成功造成围绝经期小鼠模型，但尚未对围绝经期肥胖进行联合造模，故本研究在前期研究基础上，采用高脂饮食（High Fat Diet，HFD）喂养加VCD药物诱导构建围绝经期肥胖小鼠模型，以期更加接近于生理性绝经过程，更好地模拟围绝经期肥胖发生的状态，为下一阶段进行围绝经期肥胖实验研究提供成熟、稳定的动物模型。本研究由上海市科学技术委员会青年科技英才扬帆计划（21YF1444600）提供经费支持。

1 材料

1.1 动物

SPF级8周雌性C57BL/6小鼠30只，购自北京 维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0011。饲养于上海市中医医院实验动物饲养中心，分笼饲养，室温24-26℃，湿度60%，通风良好，自由摄食摄水，昼夜节律12 h。本实验已通过上海市中医医院实验动物医学伦理委员会审查（伦理批号：2021010），实验过程严格按照中华人民共和国科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药物及配置方法

4-乙烯基环己烯二环氧化物（4-Vinylcyclohexene Diepoxide，VCD），100 mL/瓶，浓度1.094 g·mL-1（货号：94956，Sigma公司，美国）；玉米油，500 mL/瓶（货号：IC9000，索莱宝，中国）。配制方法：VCD给药量160 mg·kg-1，取15 mL离心 管，加入 玉 米油10.74 mL和VCD原液0.2 mL，配制成20 mg·mL-1的VCD玉米油溶液，以160 mg·kg-1小鼠体重的剂量进行颈皮下注射，进行造模[24]。

1.3 材料与试剂

D12492高脂饲料（脂肪含量：60% kcal），江苏省协同医药生物工程有限责任公司；血清雌激素（E2）和促卵泡雌激素（FSH）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（BPE20381（E2），BPE20419（FSH），上海朗顿生物技术股份有限公司）；0.9%氯化钠溶液10 mL/支（中国大冢制药有限公司）；苏木素伊红染色试剂盒，各100 mL（货号：C0105S，上海碧云天生物技术有限公司）；4%多聚甲醛500 mL/瓶（上海睿宝和生物技术有限公司），异 氟 烷100 mL/瓶（Baxter Healthcare Corporation）。

1.4 仪器

电子天平（型号：AL204-IC，梅特勒）；高速冷冻离心机（型号：3-30KS，SIGMA）；低温冰箱-86（型号：MDF-382E(N)，三洋）；低温冰箱-20（型号：HYC92，海尔）；光学显微镜（BX43，奥林巴斯），粘附载玻片（50片，世泰）石蜡切片机（型号：HM325，Thermo Scientific），小动物麻醉机（型号：HSIV-u，Raymain）。

2 方法

2.1 分组及给药

30只小鼠在适应性喂养1周后，行阴道脱落细胞涂片观察动情周期变化情况。选择动情周期符合以下标准的小鼠进行实验：整个动情周期持续在4-5天，包含动情前期、动情期、动情后期、动情间期4个阶段。将符合标准的小鼠随机抽取20只分为对照组及模型组，每组各10只，进行为期2个月的造模，每组小鼠耳背打孔编号，固定每日上午9:00-10:00进行称重、测量体长、腰围、阴道脱落细胞涂片等。

HFD+VCD组（模型组）：造模周期共2月，在小鼠适应性喂养后，即开始高脂饮食喂养60日，同时开始每日1次VCD注射以诱导围绝经期，连续给药14天。给药结束后继续采用高脂饮食喂养至第60日。VCD造模参照Acosta等人[24]报道的造模方法，按照160 mg·kg-1体质量于每日相同时间颈皮下注射VCD玉米油溶液，连续注射14天，每日注射1次，注射后立即放回原笼，并密切关注小鼠活动状况，14天给药结束后进行动情周期检测，若阴道涂片显示无正常动情周期变化或动情周期紊乱提示小鼠进入围绝经期，围绝经期模型成功。继续高脂喂养，喂养至60日，再次进行动情周期检测及肥胖指标检测，阴道涂片显示围绝经期，小鼠体质量增加＞20%可初步判定达到围绝经期肥胖标准，两者同时发生判断为造模成功。空白组（对照组）：采用正常饮食喂养，每日相同时间颈皮下注射160 mg·kg-1玉米油，连续给药14天，喂养至60日。

2.2 取材

给药结束继续喂养至2月龄，将对照组小鼠及模型组阴道脱落涂片显示动情周期处于后期或间期的小鼠，在异氟烷诱导浓度3%，维持浓度1.5%的气麻后眼眶采血，将麻醉后的小鼠其头部略朝下，迅速摘取小鼠眼球，用1.5 mL EP管接取，取血后置于EP管内静置30 min。后将全血在3000 rpm、4℃条件下离心20 min，离心后吸取上清液置于1.5 mL EP管中存放于-80℃冰箱待用。切除的脂肪组织立即称重，卵巢标本用4%多聚甲醛固定，做病理切片。

2.3 观察指标

2.3.1 动情周期观察

阴道脱落细胞采集及涂片：分别在造模前、注射14天VCD玉米油溶液后、造模结束后连续5天，每日9:00-10:00进行阴道脱落细胞采集及涂片。操作方法：左右抓取固定小鼠，外阴清洁消毒后，右手持200µL的移液枪，将吸有10 µL、0.9%氯化钠溶液枪头尖端插入小鼠阴道0.5-1 cm，轻轻吹打冲洗阴道3-5次，吹打的速度不宜过快，吹打冲洗后将移液枪里的阴道液滴于载玻片上，制作为阴道涂片，风干后进行苏木素-伊红（HE）染色，染色后在普通光学显微镜下进行阴道涂片观察，记录动情周期变化情况[21]。

2.3.2 体质量、体长、腰围、Lee’s指数、脂肪湿重

造模期间观察并记录小鼠的生理状况，每周固定时间对2组小鼠进行称量体质量、测量体长、腰围，小鼠体质量增加＞20%可初步判定达到肥胖标准，造模2m后进行Lee’s指数计算：Lee’s指数=体质量(g)^(1/3)/体长(cm)×103。脂肪湿重：气麻下眼球取血后立即解剖，迅速摘取小鼠脂肪组织，并用电子天平称重并记录数据。

2.3.3 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清E2、FSH水平

小鼠气麻下眼球取血，所得血清样品使用E2以及FSH酶练免疫测定试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）在实验操作手册指导下进行检测，标准品及样本加标记物抗体后37℃温育30 min，加分离剂15 min，3000 rpm离心20 min。

2.3.4 卵巢大小、湿重及组织形态学观察

将小鼠处死后从腹腔开口摘取卵巢，清除卵巢周围脂肪组织，进行拍照对比大小。并将其置于4%多聚甲醛中固定。经过75%、85%、95%、100%酒精逐级脱水，以及二甲苯透明后进行浸蜡及包埋。组织蜡块凝固后置于4℃暂存待切片，石蜡切片于二甲苯于梯度酒精及蒸馏水中进行脱蜡水化透明，并依次进行苏木素染色10 min，分化液分化15 s，流动水冲洗，蒸馏水浸泡15 min，伊红染色2 min，流动水冲洗，蒸馏水浸泡5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片观察。

2.4 统计方法

本实验所有数据采用Graphpad Prism 8.0进行统计，计量资料数据均以平均值±标准差（±s）进行表示，两组间比较，符合正态分布和方差齐性的采用Student’sTtest分析，不符合正态分布或者方差齐性采用秩和检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 两组小鼠阴道脱落细胞涂片比较

两组小鼠阴道脱落细胞涂片结果见图1。小鼠正常的完整动情周期持续4-5天，共分为4个阶段[25]。动情周期：此阶段镜下可见轮廓明显、扁平而膨圆的有核上皮细胞，少量白细胞及角化鳞状细胞（图1-C1）。动情期：镜下可见簇状、扁平、边缘不整齐、无核的枫叶状角化鳞状细胞，镜下一般少见或无有核上皮细胞及白细胞（图1-C2）。动情后期：此阶段镜下可见3种细胞类型，白细胞增多为主，少量的有核上皮细胞及角化鳞状上皮细胞（图1-C3）。动情间期：此阶段镜下几乎满视野均为白细胞，偶见少量有核上皮细胞（图1-C4）。

图1 两组小鼠阴道脱落细胞涂片结果（HE染色，×400）

对照组小鼠呈现规律的动情周期变化（C1-C4），HFD+VCD组（模型组）从给药后14天开始出现动情周期延长，维持至给药结束2月后，出现动情周期紊乱，阴道脱落细胞涂片表现为连续的动情间期，或连续的动情期，后动情期缺失，动情周期紊乱，各期变化无规律周期性（M1-M4）。

3.2 两组体质量、体长、腰围、Lee’s指数、脂肪湿重结果

由表1可见，体质量方面模型组小鼠明显重于对照组小鼠，具有统计学差异（P＜0.05）；体长方面模型组小鼠体长长于对照组小鼠，两组相比具有统计学差异（P＜0.05）；腰围上模型组小鼠腰围高于对照组小鼠腰围，具有统计学差异（P＜0.05）；Lee’s指数模型组小鼠较对照组小鼠具有明显增高，两组比较具有明显的统计学差异（P＜0.05）。

表1 小鼠体质量、体长、腰围、Lee’s指数、脂肪湿重比较(±s)

表1 小鼠体质量、体长、腰围、Lee’s指数、脂肪湿重比较(±s)

注：*P＜0.001。

组别对照组(n=10)模型组(n=10)体质量22.56±0.54*31.12±0.68体长9.47±0.25*9.84±0.21腰围6.63±0.27*8.20±0.15 Lee’s指数304.91±5.68*334.08±5.12脂肪湿重1.51±0.14*5.26±0.12

3.3 两组血清E2、FSH水平

由表2可见，经过HFD+VCD造模后造模后，模型组小鼠血清雌二醇（E2）水平相比对照组有下降的趋势，但两组相比差异不具有统计学意义（P＞0.05）。模型组小鼠血清卵泡刺激素（FSH）水平较对照组小鼠明显增高，两组比较差异具有显著统计学差异（P＜0.01）。

表2 小鼠血清E2、FSH水平检测结果（±s）

表2 小鼠血清E2、FSH水平检测结果（±s）

注：*P＜0.001。

FSH（ng·mL-1）14.56±3.63*48.62±7.84组别对照组(n=10)模型组(n=10)E2（pg·mL-1）123.16±23.72 116.42±26.55

3.4 两组小鼠卵巢大小及组织形态学结果

造模后，两组小鼠卵巢情况如下（图2），模型组卵巢较对照组卵巢体积显著减小，重量显著减轻。卵巢组织形态学结果显示（图3）：对照组卵巢组织HE染色可见卵巢结构清晰，卵泡生长活跃，清晰可见数量正常，形态规则的各级卵泡，卵泡液含量较多，黄体结构完整，发于良好，体积较大，细胞丰富。VCD+HFD造模后，模型组小鼠的卵巢明显萎缩，卵巢中总卵泡数目、原始、成熟卵泡数目均显著减少，黄体数量较多。

图2 两组小鼠卵巢大小

图3 卵巢组织形态学结果（HE染色，×100）

4 讨论

研究表明，女性进入围绝经期阶段会出现体重增加、脂质代谢异常、体内脂肪堆积等现象，进一步发生围绝经期肥胖[26]。而围绝经期肥胖容易加重围绝经期症状、延长围绝经期时长，严重者甚至会诱发心血管疾病、代谢综合征等[27-28]，因此，治疗围绝经期肥胖对于围绝经期女性的身心健康具有重大的临床意义。中医认为女性七七，天癸竭，任脉虚，太冲脉衰少，是女性生理和心里变化重大的一个阶段，属于中医学“绝经前后诸证”范畴，根据不同症状可以归类于中医“郁证”“脏燥”等，主要与肝、肾、脾三大脏腑相关。通过中医药干预改善肝郁可以有效缓解围绝经期抑郁、焦虑等情况[29-30]，调节脾肾功能可以避免围绝经期代谢综合征的发生[31]。近年来，中医药学者开始关注围绝经期肥胖的相关研究[12][14][26]。但目前局限于临床研究，尚缺乏中医药干预围绝经期肥胖的动物实验研究。

本次研究结果表明，模型组小鼠的阴道脱落细胞涂片显示小鼠动情周期紊乱，出现了动情周期延长、部分动情期的缺失、某动情期的停滞等，说明造模后，模型组小鼠卵巢功能出现衰退，2个月阴道脱落细胞涂片观察发现，小鼠的动情周期仍处于紊乱状态，无规律出现，整个动情周期延长，该研究结果与上海龙华医院运用超促排卵方法诱导围绝经期模型阴道涂片结果相互印证[32]。因此，HFD+VCD诱导模型小鼠的阴道脱落细胞涂片结果说明该造模方法符合围绝经期阶段卵巢功能改变，且能够维持2月左右的时长，具有一定的稳定性。

相关研究表明，单纯的经过VCD诱导，也会引起小鼠出现体重增加，但增加幅度有限，并不能稳定的达到肥胖的标准[11]。本研究HFD+VCD模型组在给药结束后，模型组小鼠体重有所增加，但与对照组未产生统计学差异，也验证了该观点。故本研究采用了HFD+VCD喂养连续2月，2个月后肉眼观察两组小鼠体重变化明显。肥胖相关指标显示，模型组体质量明显高于对照组，体长明显长于对照组，腰围也高于对照组，Lee’s指数也有显著的差异，小鼠造模成功取材后称得模型组小鼠脂肪湿重较对照组小鼠脂肪湿重具有明显差异。说明小鼠在单纯VCD诱导后体重会有所增加，与围绝经期体重增加相似，而加上高脂饮食诱导2月后成功出现围绝经期肥胖模型。

经过HFD+VCD造模后，模型组小鼠血清E2水平较对照组有所下降，但无统计学差异，说明卵巢功能有所衰退，E2水平下降。模型组小鼠血清FSH较对照组小鼠血清FSH明显增高，说明造模后模型组小鼠卵巢功能衰退，E2下降后FSH代偿性增高，也验证了FSH与E2之间负反馈关系的存下。因此经过HFD+VCD造模后，在血清性激素水平上，模型组小鼠血清水平较好的模拟了围绝经期小鼠性。较对照组相比，卵巢组织体积缩小、重量明显减轻，提示模型组小鼠卵巢发生萎缩，符合围绝经期小鼠卵巢状态。根据2018年中华中医药学会中药实验药理专委会《关于围绝经期综合征动物模型制备规范（草案）》中对围绝经期综合征动物卵巢组织病理变化标准[33]，本研究对照组小鼠卵巢组织属于“-”，卵巢HE染色可见各级卵泡生长良好、成熟卵泡存在，黄体发育好，颗粒细胞层次明显，卵泡液丰富，血管丰富；模型组小鼠卵巢组织没有卵泡，卵巢萎缩，无血管。说明经过HFD+VCD造模后，模型组卵巢组织形态学的改变提示卵巢功能的衰退，符合围绝经期小鼠的卵巢病理组织变化。

综上，本研究创新性的采用HFD喂养结合VCD药物诱导，此次动物实验研究结果表明：HFD喂养加上VCD药物诱导能够成功促进卵巢功能衰退，加速围绝经期小鼠发生肥胖，且能够满足围绝经期小鼠动情周期紊乱、血清E2相对下降、FSH水平显著增高、卵巢组织病理变化。该方法造模的结果更接近于生理性绝经后出现的围绝经期肥胖的表现，模型较为稳定，可持续2月左右。在接下来的中医药领域关于围绝经期肥胖的动物研究中，可以采用HFD+VCD诱导制备围绝经期肥胖小鼠模型，模型能够模拟接近生理状态下绝经的状况，本研究结果为中医药领域研究围绝经期肥胖的小鼠模型制备提供了参考依据。