基于糖脂代谢基因探讨茯苓多糖干预乳腺癌细胞增殖的分子机制＊

刘雨彤，宋 囡，王 奡，张 新，戴梦竹，杨 莹，陈文娜

（辽宁中医药大学研究生学院 沈阳 110847）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占所有癌症发病率的首位[1]。在我国，尽管对乳腺癌的宣传预防和筛查工作不断开展，但乳腺癌的发病率和死亡率仍逐年上升，已严重危害我国女性健康。因此，仍需要进一步探索乳腺癌的发生发展机制，寻找新的抗癌作用靶点。

中医认为，乳腺癌的发病机制多为肝气郁结、脾虚痰浊，《灵枢·刺节真邪篇》有曰“已有所结，气归之，津液留之凝结日以易甚，连以居，为昔瘤。以手按之坚，有所结。”因此，现阶段众多医家治疗乳腺癌惯用治疗原则为疏肝解郁，健脾化痰，在治疗方剂中常选用茯苓[2-3]。茯苓具有化痰、利水、健脾的功效，从多方面发挥治疗乳腺癌的作用。茯苓多糖（Poria cocos polysaccharides）是茯苓最主要的有效成分之一，具有增强机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗放化疗毒性等作用[4-5]。

目前很多研究发现糖代谢和脂代谢与乳腺癌患者的病情发展及预后有很大相关性。糖代谢改变称为Warburg效应（Warburg effect）即肿瘤细胞要以更高的效率吸收更多的葡萄糖来产生能量和满足快速生长的需求[6-7]。也有报道发现肿瘤微环境中存在明显的脂质代谢异常，脂质加快从头合成与外部摄取以满足癌细胞的快速生长。乳腺组织中含有丰富的脂肪组织，脂质代谢的异常也使乳腺癌更加容易复发和转移。因此，挖掘糖脂代谢上的相关基因可为乳腺癌的临床诊断及治疗提供新的思路和方法。

当前虽然有文献报道关于茯苓多糖影响乳腺癌细胞凋亡及迁移机制的研究[8-10]，但国内外尚未见从糖脂代谢角度深入探讨茯苓多糖治疗乳腺癌分子机制的研究。本研究首次将茯苓健脾化痰的药效原理与改善乳腺癌患者糖脂代谢的现代医学理论相结合，探讨茯苓多糖治疗乳腺癌的分子机制，为完善茯苓多糖治疗乳腺癌的具体机制上提供了新的靶点和思路。

1 资料与方法

1.1 实验材料、试剂

1.1.1 细胞株

人乳腺癌细胞MCF-7细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 主要药物试剂

茯苓多糖购自源叶生物有限公司（批号C25F7Y1 0033）；PBS缓冲液购自武汉普诺赛生命科技有限公司（批号WH0621P171）；培养基DMEM基础培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司（批号WH0111201909）；胎牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司（批号TBD21HY）；二甲基亚枫（DMSO）购自北京索莱宝生命科技有限公司（批号710N0310）；胰酶购自北京索莱宝生命科技有限公司（批号NO.T1350）；青霉素-链霉素溶液（双抗100×）购自武汉普诺赛生命科技有限公司（批号WH011120191 0SP）；CCK8试剂购自弗德生物（批号FD3788）；cDNA反转录试剂盒购自近岸蛋白质科技有限公司（批号0516951 E047-01B）；RT-qPCR试剂购自bimake.com（批号B522102）

1.1.3 仪器

酶标仪为NanoQuant infinite M200Pro；超微量紫外分光光度计为ND5000；PCR仪为BIO-RAD T100 Thermal Cycler；PCR扩增仪为QuantStudio3；培养箱为Thermo Fisher科技公司

1.2 实验方法

1.2.1 数据挖掘与筛选

在GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中输入检索词breast cancer，限定检索范围为Homo sapiens，筛选检索结果得到目标数据集。运用GEO自带分析软件GEO2R，将乳腺癌组织样本设定为BC组，匹配到的癌旁及正常组织样本设定为normal组做差异表达基因的分析。将分析出的差异基因按|log2FC|＞2，P＜0.05再次进行筛选，取两个数据集交集。FC（fold change）表示差异表达基因的差值倍数。

1.2.2 差异基因生物学功能分析和处理

利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对筛选后的差异基因进行GO功能分析，对交集基因可能参与的生物学过程（biological process,BP）、细胞组分（cell component,CC）、分子功能（molecular function,MF）及信号通路进行注释和分析，并重点关注BP中关于糖脂代谢的基因。再将基因导入STRING在线数据分析网站（https://string-db.org/），得到PPI网络互作图（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）

1.2.3 细胞培养

乳腺癌细胞MCF-7用含10%-20%胎牛血清、青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基，在37°C、CO2浓度为5%的培养箱中培养，观察并记录细胞的生长状态。

1.2.4 药品配制

称取0.04 g茯苓多糖溶于50 µL DMSO，加入10 mL PBS配成浓度为4 mg·mL-1的药品母液并过细胞滤器。将母液分别配成10，50，100，200，400 µg·mL-1含药培养基用作茯苓多糖给药组。

1.2.5 CCK8给药分组及结果测定

取对数生长期的MCF-7细胞配成细胞悬液，每孔5000个细胞接种于三块96孔板，置于培养箱5%CO2，37°C培养24h待细胞长满至80%-90%，加入5个不同浓度（10，50，100，200，400 µg·mL-1）茯苓多糖含药培养基，每孔100µL，分别培养24 h，48 h，72 h。对应时间取出孔板，弃去旧培养基，每孔加入新鲜培养基100µL后，加入CCK8溶液10µL，培养箱内孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度OD值。根据公式计算细胞增殖抑制率。细胞相对活力：细胞存活率=(药物处理组平均OD-空白对照平均OD)/(正常组平均OD-空白对照平均OD)×100%；增殖抑制率（inhibition rate，IR%）=1-细胞存活率。

1.2.6 血清总RNA提取及逆转录反应

将细胞设对照组和给药组，适应性培养1天。待细胞长满至80%-90%时，给药组加入根据CCK8筛选出最佳药物有效浓度的含药培养基并培养对应时间。根据RNA提取试剂盒提取两组细胞的总RNA。超微量紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度。根据总RNA检测浓度进行稀释，并用反转试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。

1.2.7 RT-qPCR检测细胞基因表达情况

PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计合成生产，各基因引物序列见表1。PCR反应体系为20µL，分别加入2×SYBR Green qPCR Master Mix、上下游引物、ROX Reference Dye、去离子水及cDNA模板，GAPGH为内参基因，每个基因设置分组设三个复孔。将反应液放入Quantstudio3实时荧光定量PCR仪中进行基因的PCR扩增，实验重复三次。根据各组CT值，计算基因相对表达量=2-△△CT。

2 结果

2.1 筛选差异表达基因

筛选检索内容得到数据集GSE139038和GSE15852。其中GSE139038包含了41例患者和18个癌旁样本。GSE15852包含43个癌组织及43个匹配的癌旁组织。GEO2R分析得到两组差异表达基因和火山图（校正P值Padj＜0.05），见图1。将差异基因按|log2FC|＞2，P＜0.05再次进行筛选后，GSE139038得到差异基因526个。GSE15852得到差异基因57个。将二者差异基因用VENNY2.1.0取交集共得到差异基因27个，其中25个基因上调，2个基因下调（图1）。

图1 差异基因火山图及交集差异基因

2.2 差异表达基因功能分析

将27个交集差异基因输入DAVID6.8，BP显示有关糖脂代谢的生物学过程有主要有“糖异生”“糖代谢过程”“脂质代谢过程”“脂质储存”“脂肪酸生物合成过程”过程（表2）。参与这些生物学功能的基因主要有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、清道夫受体白细胞分化抗原36（CD36）、瘦素（LEP）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、小窝蛋白-1（CAV1）、乙酰辅酶A羧化酶B（ACACB）。这些基因与糖脂代谢密切相关，可作为药物干预的靶基因。PPI互作图显示LPL与LEP两个节点之间的相互作用关系最为显著，且位于网络中心，与其他基因关联度较高（图2）。

图2 糖脂代谢基因的PPI网络分析

表2 生物学过程及基因名称

2.3 CCK8药物浓度筛选结果

铺板后细胞生长状态良好。细胞给药干预24 h，48 h，72 h三个不同时间后CCK8结果显示随着给药浓度升高，细胞增殖抑制效果越好。24 h、72 h时间点最高细胞增殖抑制率分别为28.23%、28.73%。48H处理组抑制细胞增殖的效果最为明显，在400µg·mL-1时达到48.93%（图3）。

图3 CCK8细胞增殖抑制率结果

2.4 RT-qPCR表达结果

经茯苓多糖给药干预，处理组7个基因的相对表达量较对照组下调明显，差异具有统计学意义（P＜0.001）（图4）。

图4 药物对基因表达的影响

3 讨论

乳腺癌在女性好发的癌症中极为常见，其特点为侵袭性高、易向周围组织如淋巴组织、骨组织、肺组织转移，从而使病情难于控制[11]。因此术后高转移率和复发率成为危害女性健康的杀手。研究表明乳腺癌的发病机制主要与机体长期处于较高雌激素水平下刺激乳腺上皮细胞相关，家族史中有BRCA1、BRCA2等基因位点突变可明显增加乳腺癌的发病机率[12]。研究表明肥胖是导致多种癌症发病的重要危险因素，与癌症的发生发展有密切关系[13]。在乳腺癌患者体内的肿瘤微环境中的脂肪组织与癌细胞相互交织[14]，使癌细胞更加利于利用代谢旺盛的营养物质，加速供给癌细胞生长。同时，一些癌症通路的激活进一步引起癌症中关键转录因子、蛋白水解酶以及信号分子的激活，加速了肿瘤的增殖、转移和侵袭。糖脂代谢中葡萄糖的代谢异常主要表现为Warburg效应，脂质的代谢异常包括脂质的从头合成与外部摄取。糖脂代谢异常引起的代谢重编程一直是肿瘤研究的热点和核心，因此关注糖脂代谢基因的变化、探讨有效药物治疗机制是当前探索发掘乳腺癌治疗的关键任务。

在本研究中，课题组运用GEO数据挖掘，使用GEO2R在线工具分析了GEO数据库中的两个乳腺癌患者的芯片数据集。经过筛选后取两数据集的交集差异表达基因，目的是为了寻找患者共性的差异基因，使差异基因的探讨更具有意义。通过DAVID6.8对差异基因进行GO功能注释选取生物学过程中与糖脂代谢相关的生物学功能，挖掘到相关的目的基因。BP中与糖脂代谢相关的基因主要有7个，在乳腺癌中的表达均上调，其中PCK1、LEP、LPL、CD36基因参与多个糖脂代谢过程中，说明这些基因从多方面多角度对糖脂代谢进行调节。因此抑制这些基因的表达对改善糖脂代谢水平、恢复细胞内正常代谢活动是很有意义的。另外，在PPI结果中发现LPL与LEP两个节点位于网络中心位置，且存在明显相互作用关系，可见其在糖脂代谢基因中的地位是非常重要的。

在本研究中发现基因PCK1是调节糖异生的主要控制点，由该基因编码的胞浆酶与GTP一起催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，并释放CO2和GTP。最新研究发现了其在肝癌细胞中参与脂代谢的重要作用[15]，从而将糖代谢与脂代谢联系起来。肝癌细胞中的PCK1在Ser90位点磷酸化转位到内质网，利用GTP作为磷酸供体，进而磷酸化INSIG1/2，破坏INSIG蛋白与固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）与护送蛋白（SCAP）的相互作用，SCAP-SREBPs向高尔基体移位，活化SREBPs并使下游脂肪合成相关基因发生转录，促进肿瘤的增殖。本研究中经过茯苓多糖处理后的PCK1表达下降，其机制可能是抑制了PCK1磷酸化，干预了后续结合过程，其在乳腺癌细胞中的具体作用机制有待进一步研究证实。基因LEP是一种脂肪细胞相关激素，其水平在肥胖中明显升高，在肥胖介导的癌症中起关键作用。LEP已被证实它能通过调节脂肪组织质量影响肿瘤细胞的生长，其表达与乳腺癌的发病率和生存率密切相关[16-17]。在脂质代谢中LEP起同样关键的作用，它能通过激活自噬及PI3K/AKT信号通路引起SREBP蛋白的表达增高，促进癌症的迁移和侵袭[18-19]。LEP还在促进肿瘤细胞上皮-间质转化上发挥作用[20]。值得一提的是LEP受体LEPR（leptin receptor）在本研究数据库数据的乳腺癌组织中表达同样升高，且有研究报道了其过度表达对乳腺癌的预后具有预测价值[21]。在本研究中经药物干预下调了LEP表达，在未来的研究中对其受体LEPR的抑制作用有待进一步验证并探究具体的分子机制。小窝蛋白-1（CAV1）是一种致癌膜蛋白，与癌症关系密切[22]。能参与细胞内吞、细胞外基质组织、胆固醇分布、细胞迁移并和信号传导有关[23]。Wang Z等[24]研究发现桦木酸可通过调节Cav-1/NF-κB/c-Myc途径抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MD-MB-231中的有氧糖酵解，抑制乳酸产生、葡萄糖摄取和细胞外酸化率（ECAR），说明CAV1可作为治疗有氧糖酵解的靶点。另外，CAV1能通过调控细胞周期、调节肿瘤微环境（TME）等方式影响细胞增殖，还能通过调节凋亡途径蛋白及诱导细胞自噬影响细胞凋亡[25]。脂肪酸受体CD36可运输脂肪酸进入肿瘤细胞，是外源性脂质调节的关键靶点，促进肿瘤生长和启动转移[26]。高脂肪饮食以CD36依赖的方式特异性地提高CD36+转移起始细胞的转移潜能。临床上，CD36+转移起始细胞的存在与许多类型的癌症的不良预后相关[27]。Kwan Hiu-Yee[28]发现芹菜素通 过STAT3/CD36轴降 低STAT3磷酸 化、CD36和PPAR-γ的表达并抑制脂肪细胞分化进而抑制脂肪生成，为治疗乳腺癌提供了新思路。基因LPL是胞外脂解的关键酶，有调节脂质稳态的作用。恢复LPL的正常水平对改善脂质代谢水平密切相关。基因RBP4在乳腺癌中的表达未见报道，但有研究报道关于血清中的RBP4参与新诊断2型糖尿病患者的糖脂代谢和胰岛素抵抗作用机制[29]，笔者认为从糖脂代谢的角度出发探讨以RBP4为靶点的乳腺癌的机制研究可能成为新的研究方向。有研究证实了基因ACACB与肥胖在糖尿病肾病的关系[30-31]，另有学者运用数据挖掘发现该基因与HER2+型乳腺癌脑转移相关[32]，还将其用于新辅助化疗的作用靶点[33]。

乳腺癌在中医理论里称为“乳岩”，在南宋时期的《妇人大全良方》中有关于此疾病的描述记载。乳腺癌的中医病机是由忧郁思虑等情志所伤，肝、脾等脏腑功能失调，进而寒凝、痰聚、血瘀，久病之下，经络痞涩，聚结成核。另外，先天禀赋不足的阳虚体质也易发生痰凝血瘀进而促进乳腺癌发生进展。人体内水谷的运化失常导致的脾虚痰浊在现代医学中表现为脂质代谢异常。乳腺癌患者阳虚夹杂痰湿癌毒的情况与现代医学中脂质代谢异常引起的肿瘤微环境变化恰有相似之处[12]。因此，本研究从影响糖脂代谢基因的角度入手，利用温阳补虚，化痰散结的治疗原理来调节恢复患者体内的气血阴阳平衡。茯苓具有利水化痰、补脾固本的作用，在治疗乳腺癌的中医名方中极为常见。目前茯苓多糖抗肿瘤的功效已在抑制乳腺癌细胞增殖迁移方面进行了相关研究，但都只进行了单独基因及个别通路的验证，茯苓多糖抗肿瘤的机制研究还不够完善，且关于影响代谢方面的研究仍不十分清楚。中药对肿瘤微环境中癌细胞的抑制作用是多方面、多角度的[34]。本研究发掘验证到的相关基因对于深入探讨茯苓多糖治疗乳腺癌的分子机制具有重要意义。

综上所述，本研究挖掘GEO数据库中的芯片数据，分析并聚焦了7个糖脂代谢差异基因，利用生物信息学分析工具发现基因LEP和LPL在糖脂代谢通路上发挥了重要作用。qPCR的结果证实经茯苓多糖处理后乳腺癌细胞内过度表达的糖脂代谢基因明显下调。糖脂代谢基因的发掘验证进一步完善了茯苓多糖干预糖脂代谢及疾病治疗的分子机制，为更多中药成分干预乳腺癌的发生发展及新药靶点的创新研究提供了新的切入点。