哺乳动物血红素降解途径中蛋白质的相互作用研究进展

胆红素(BR)的主要来源是血红蛋白，正常人每日由红细胞破坏生成的血红蛋白约7.5 g, 生成胆红素4 275 μmol(250 mg)，占总胆红素的80%～85%。血红蛋白主要来自衰老的红细胞。另外171～513 μmol(10～30 mg)的血红蛋白来源于骨髓幼红细胞的血红蛋白和肝内含有亚铁血红素的蛋白质(如过氧化氢酶、过氧化物酶及细胞色素氧化酶与肌红蛋白等)，这些胆红素称旁路胆红素，占总胆红素的15%～20%。每日产生胆红素的最高量为25 650 μmol

。血红素含有一个卟啉环和一个中心铁原子。在血红素降解过程中，血红素加氧酶以NADPH和氧(O

)破坏卟啉环，导致铁(Fe)、一氧化碳(CO)和胆绿素的释放。胆绿素(BV)由胆绿素还原酶还原为胆红素。活性氧(ROS)可以将胆红素回收为胆绿素。在肝脏中，胆红素通过UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)与葡萄糖醛酸结合，排泄到胆汁中

。

目前已用突变结合动力学、光谱(荧光和核磁共振)、表面等离子体共振、交联、凝胶过滤和分析超速离心研究等评估血红素加氧酶-2(HO-2)与细胞色素P450氧化还原酶(CPR)和胆绿素还原酶(BVR)的相互作用。研究显示，HO-2的1H-15N-横向弛豫优化谱 (TROSY)核磁共振谱揭示了在HO-2的血红素表面附近受CPR影响的特定残基，包括Leu-201，表明这些残基位于HO/CPR界面，结合并运输血红素到细胞核，并调控HO-1的表达。HO-2残基Leu-201和Lys-169的丙氨酸取代导致CPR的Km值分别增加3倍和22倍，这与这些残基在CPR结合中的作用一致。沉降速率实验证实了HO-2·CPR复合物的瞬态性质(

=15.1 μm)。研究结果还表明HO-2和BVR形成了一个非常弱的复合物，只有通过交联才能捕获。荧光猝灭实验表明，BVR与HO-2的结合很弱，而且之前报道的BVR对HO的高亲和力是人为的，这是由于游离血红素(从HO分离)对BVR荧光的影响所致

。

1 血红素代谢的精确调控

血红素代谢的精确调控对细胞至关重要。血红素是芬顿化学产生活性氧的活性催化剂。血红素也是许多参与电子转移、氧转运和氧化还原酶学的蛋白质所必需的辅基团。哺乳动物血红素降解途径由两个酶步骤组成，即由血红素加氧酶和胆绿素还原酶介导。CPR是HO催化的电子供体。HO是哺乳动物细胞中唯一降解血红素的催化剂(反应1)。在需要O

的反应中，HO催化血红素转化为胆绿素。NADPH和CPR，它们传输7个电子，如反应1所示。然后BVR将胆绿素转化为胆红素(反应2)，后者与葡糖醛酸发生结合，并从体内排出。

血红素+7e

+ 3O

—→胆绿素+CO+Fe

+3H

O ⑴

8月20日，证监会公布市场禁入决定，从当日起，对内幕交易人潘某采取10年证券市场禁入措施。在禁入期间内，潘某不得从事证券业务或担任上市公司、非上市公众公司董事、 监事、高级管理人员职务。

胆绿素+ 2e

—→胆红素⑵

HO以两种主要的异构体形式存在，即HO-1和HO-2。尽管HO-3的催化活性很低，但其生物学作用和相关性尚不确定。HO-1和HO-2具有高度同源性和相似的酶活性(55%的同源性和76%的相似性)。然而，这两种异构体有着不同的表达和调控模式。HO-1是转录调控的，在大多数组织中都有表达，而HO-2在少数组织中表达，主要是在大脑和睾丸。这两种HOs都具有C端跨膜区域，将它们与内质网相连。然而，由于全长蛋白质溶解性差，大多数酶研究都是以不含C末端区域的稳定的可溶形式HO的情况下进行的。这两种HOs的一个主要区别是HO-2含有3个血红素调节基序，由前半胱氨酸组成，而HO-1则完全缺乏半胱氨酸。这些血红素调控基序中的两个位于HO-2的C末端，就在跨膜区的前面。当它们处于二硫醇状态时，HO-2对血红素(相对于二硫状态)的亲和力显著降低，这表明血红素调节基序作为一个氧化还原开关，对细胞氧化还原状态的变化起着控制活性的作用

。

BVR催化血红素降解的第二步，即胆绿素还原为胆红素(反应2)。BVR是一种可溶性蛋白，利用NADH或NADPH的两个电子，使其在不同的pH值下具有双辅因子特异性。BVR除了具有典型的酶功能外，还能结合并运输血红素至细胞核

。此外，BVR是一种双重特异性激酶(Ser/THR和Tyr)，因此它与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞信号通路有关

。

高校档案馆创新服务应在档案利用这个环节找到突破口。随着信息技术和人工智能研究水平的不断提高，档案知识服务也应运而生。高校档案馆具有丰富的馆藏档案资源，将这些资源进行加工处理，将档案信息资源数字化，方便查询服务，拓展档案知识服务方式，构建档案知识服务平台，通过师生访问服务平台，向档案馆提出服务需求，档案馆根据师生的需求为其提供相关的档案信息或者向师生主动推荐相关知识。高校档案馆也可以通过这种反馈和师生的参与度来分析师生关注的问题，有针对性收集档案资源，更好地为教学科研服务。

两项通过荧光猝灭研究和表面等离子体共振(SPR)研究报道了HO-1和BVR之间的相互作用

。荧光猝灭研究表明，具有高亲和力的HO-1·BVR复合物(

=0.2 μm)已形成，而SPR研究报告称，BVR与CPR竞争与HO-1结合。然而，通过赖氨酸乙酰化保护试验鉴定HO-1/CPR界面的研究未能找到HO-1/BVR相互作用的证据

。在单循环条件下，HO-1反应的限速步骤是胆绿素的释放，但在BVR存在下，这一步的速度加快

。这表明这两种酶之间的动力学耦合。因此，虽然一些证据支持在HO-1和BVR之间形成高亲和力复合物，但其他证据对此提出了质疑。此外， HO-2能够与BVR想互作用的程度还没有得到解决。HO与其反应伙伴之间的蛋白质/蛋白质相互作用可能在调节其各种性质(包括细胞定位和酶活性)中发挥重要作用。此外，由于它们表现出不同的转录调控模式，HO-1和HO-2对BVR和CPR的亲和力可能有所不同。

基于先前荧光猝灭研究的基础，提出了HO-1与BVR形成高亲和力配合物，Andren等

用各种生化和生物物理方法对类似的HO-2·BVR复合物进行表征。但是发现，在

N标记的HHO-2不引起化学位移扰动，而在HHO-2光谱中的10

个指定共振中，只有5个表现出与BVR相关的强度下降。在对超视距敏感的残基中，有3个位于晶体结构的表面，可合理地参与与BVR的结合(Lys-176、Gln-196和Tyr-229)。相反，在等摩尔CPR的相同条件下，48个指定的HO-2共振表现出强烈的CPR依赖效应。这些结果表明，与CPR相比，BVR结合HHO-2的亲和力较弱。

2 HO与CPR的相互作用

稳态动力学分析表明，HO-2在催化核心的血红素结合面附近的区域参与了CPR的结合。例如，HO-1和HO-2，它们在催化核心区域具有高度的结构相似性

，展示类似的KmCPR值(0.5～0.7 μm)。此外，在HO/CPR界面，Lys-169(或HO-1中的Lys-149)和Leu-201的核心残基被丙氨酸取代，导致CPR的

值显著增加。例如，k169A在CPR中的

值增加20倍。

对于CPR，与先前的SPR和乙酰化保护试验一致

。

SPR是研究蛋白质相互作用的一种有价值的方法，SPR研究结果表明CPR与HO-1(

=20.5 μm)和HO-2(

=16.7 μm)与CPR依赖的关联率和CPR无关的解离率。研究发现游离血红素与固定化人CPR也有很强的结合反应。核磁共振实验证明了apo-HOs的使用是正确的，这表明CPR可以结合HO-2的两种形式(apoHO-2和血红素结合),但目前尚不知道血红素与CPR结合的生理基础，所以这可能是一种非特异性的效应。BVR曾经被证明与血红素结合，并将血红素输送到细胞核中

。虽然通过SPR观察到apoHO与固定化CPR没有结合，但CPR的构象对HO的结合是至关重要的

，并有可能使CPR的固定能稳定与HO亲和力较低的构象。

给予对照组患者甲泼尼龙片(生产单位:Pfizer Italia S.r.l.(意大利),批准文号:H20150245,药物成分:化学药物,规格:4mg×30s)进行治疗,每天口服甲泼尼龙片40mg,可根据患者的实际情况增加或减少药物服用剂量,观察患者病情稳定后,每隔两周减少4mg用量;

我们四个之间，我跟舒曼的感情深一点，有些事我们认识很一致。舒曼也喜欢读课外书，只是他更偏好于那些音乐书而已。他还试着作曲。我觉得他有这方面的天赋，他挺了不起的。

综上所述，在多步骤HO-2反应中，HO-2与CPR之间的过渡配合物形成并迅速离解，产生的电子转移复合物包括HO-2残基、Leu-201和Lys-169。HO-2和CPR相互作用的瞬态性质很可能是一个重要的催化特性，特别是在该系统和其他系统中，在每个催化循环中必须通过多个电子来完成。

至于HO-2与CPR是否形成复合物，通过波谱(NMR、荧光)、稳态动力学和其他生化[色谱、分析离心和表面等离子体共振(SPR)]的研究，获得了关于这两种蛋白质相互作用性质的新信息

。

沉降速度实验也提供了HO-2和CPR之间存在动态复合体的证据，即

(15.1 μm)的值，该值与从SPR数据中计算的值类似。HO-2·CPR配合物也可以通过化学交联HO-2的氨基，通过15.7Å栓在与CPR表面反应的Cys残留物上。当然，后者是不可逆转的，设计用于捕捉甚至是高度瞬态的相互作用。

HO反应涉及许多步骤，包括血红素结合、电子转移、3 mol氧结合、氧活化、胆绿素释放等。人们普遍认为，HO-1催化循环中的限制速率的步骤是Fe(Ⅱ)-verdoheme(Ⅱ)-verdoheme(绿泥石)的开环

。然而，该赖氨酸变异有可能受到另一步骤的速率限制。

核磁共振实验还表明，HO-2与CPR之间存在相互作用。主要的证明是，由于时间平均分子量的大幅度增加，导致核心共振峰强度的总体和大幅度损失。此外，由于交换展宽和CSP导致的多峰强度损失发生在多个信号中，而不是所有信号。后一种观测结果与快速/中间NMR漂移时间标度上的特定结合和结合动力学相一致(

～100 s

)

。

3 HO与BVR的相互作用

为深入了解调节HO-2活性的蛋白质水平模式，解决HO-1和HO-2与其结合伙伴的相互作用有关的差异(或缺乏这种差异)，进行核磁共振(NMR)、动力学、分析超离心、凝胶过滤、交联、SPR和荧光猝灭研究。实验表明，HO-1和HO-2与CPR形成复合物，与CPR相比，HO-2与BVR的相互作用较弱，只能通过交联等不可逆的方法来检测。研究结果显示HO-2·CPR复合物在HO-2血红素结合面附近的界面，该界面包括Leu-201和Lys-169两个残基。研究表明，HO/CPR界面既包括疏水作用，也包括电荷相互作用

。证明了HO-1和HO-2在HO活性所需的瞬态电子转移复合物中与CPR结合。然而，BVR与HO-2之间的相互作用弱到无法检测，因此，在细胞的生理环境中可能不起重要作用。

因为TROSY实验表明HO-2与BVR没有很高的亲和力，重复描述hHO-1·BVR配合物，但额外的控制表明，游离血红素强猝灭BVR-CPM荧光，与HO无头。使用光学吸光度法来验证BVR与血红素结合的能力

，这个Kd血红素·BVR复合物的值在两个实验中有所不同，吸光度数据表明血红素与BVR的结合量大于血红素。此外，标记的BVR包含两个特定的位点(Cys-292或Cys-293和Cys-204)。荧光猝灭研究可以监测其中一个荧光团附近高亲和力位点上一个血红素与BVR的结合，尽管光吸收研究可能反映多个血红素结合事件。因此，旨在研究HO-2和BVR相互作用的荧光猝灭研究实际上报道了血红素在与hHO分离的溶液中的结合，而不是hHO与BVR之间的直接相互作用。事实上，对HO·BVR复合物的检测需要使用化学交联等方法，即使是瞬时的配合物也可能被捕获。

这一结果描述了HO与BVR的低亲和力是很重要的，因为它阐明了BVR与HO反应的偶联机制。结果表明，BVR改变了HO-1反应从胆绿素释放到铁-胆绿蛋白血红素(Fe

-verdoheme)中间体向Fe

-胆绿素转化的限速步骤

。表明胆绿素在这两种蛋白质之间存在通道的可能性。然而，目前看来，超视距对HO速率限制步骤的影响是由HO和BVR反应的动力学耦合而非衬底沟道产生的。超视距与HO-2的结合非常弱，因此，需要稳定配合物的衬底沟道是不可能的。因此，BVR只是简单地将胆绿素从其产物复合物中与H结合，通过影响质量平衡来增强HO反应。

4 胆绿素还原酶缺乏情况下血红素代谢新见解

如前所述HO-1利用NADPH细胞色素P450还原酶的分子氧和电子将血红素转化为CO、亚铁和BV。用纯化的30 kDa形式的HO-1酶研究通常使用含有BVR的耦合分析法，该酶可将BV转化为Bilirubin,BR。BVR被认为是最理想的HO-1活性所必需的。在无BVR的情况下，是否可以通过BV生成或铁释放(使用亚铁螯合剂，铁锌)直接监测HO-1活性。通过对3种最终产物的分析，发现在过氧化氢酶的存在下HO-1活性被激发，代谢为BR。

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合理采集与处理样品。研究发现，食品中包含着多种微生物，且具有十分复杂的结构，增大了食品微生物检验的难度。针对这种情况，就需要严格依据实验室操作要求，科学采集与处理样品，促使食品微生物检验准确性得到保证。

HO催化血红素降解的限速步骤.该反应需要分子氧和还原当量，这是通过与NADPH细胞色素P 450还原酶(CPR)相互作用提供的。该反应消耗7个电子和3个分子氧，并产生BV、一氧化碳和铁血红素。降解的下一步是BVR催化BV转化为BR。有证据表明CPR和BVR都与HO-1有竞争性的结合

。

在此之前发现过氧化氢对HO-1的催化有明显的抑制作用，过氧化氢酶的加入大大提高了催化活性的检测。James等

测试了在没有BVR的情况下，sHO-1反应能有效进行的可能性。研究发现在BVR存在和没有BVR的情况下，血红素加氧酶-1的缩短形式(sHO-1)的代谢率是相等的。实验还表明，铁螯合剂铁锌在生理pH条件下可直接捕集sHO -1生产的亚铁

。最后，通过直接监测sHO -1的活性，可以独立地评估影响酶活性的条件与影响HO-1酶活性的条件。

James等

通过实验表明sHO-1在没有BVR的情况下以相同的速率(甚至在某些条件下更高)发生血红素分解代谢，证明了BVR并不是最优sHO-1活性所必需的。这一发现极大地改变了由sHO-1催化的蛋白质相互作用的功能含义。最重要的意义是酶在体内的活性不依赖于BVR的表达水平。由于sHO-1不依赖于BVR，影响这两种酶活性的条件可以被分化。

对HO-1活性的3种测定也导致了对反应最适pH值的不同解释。在较低的pH值下，BV和BR的产生所测得的HO-1活性显著下降(pH<7.2)。然而，铁锌法测定的代谢速率在pH值范围内是相对一致的，表明螯合剂在较低的pH值下可能促进HO-1活性部位的铁的释放。因此，铁锌矿法准确测定sHO-1活性的通用性可能局限于pH值的生理范围。结果还表明，偶联HO-1法的pH值向高pH值方向移动，这可能是由于以NADPH作为辅助因子时反应的pH值较高(8.5)和BVR活性低于pH7.0所致。

袁安并不相信母亲的话，但还是背着行李卷，被母亲推出了家门。门窗在他的背后关上，她一定是吹灭了灯，坐在黎明前暗黑的房间里一边画妆，一边流泪，像一只赶走狼仔，在石洞里自己舔着伤口的母狼。

如前所述铁与铁螯合剂铁锌的配合物，为直接测定sHO-1代谢过程中的铁释放速率提供了一种有用的条件。研究结果表明，在250 μmol/L和中性pH条件下，螯合剂对sHO-1活性没有影响。此外，缓冲组分对铁锌矿和BV测定的活性也有相似的影响。因此，铁锌法是直接测定酶活性的一种可靠的方法，适用于直接测定sHO-1活性的检测限

。

由于不需要BVR来提高sHO-1的代谢率，现已得到证明，通过直接测定HO-1的活性来评估其酶学性质是更好的方法。此外，没有必要用BVR来研究HO-1与其他膜蛋白如CPR和细胞色素P 450的相互作用

。

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