固相萃取-气质联用测定黄瓜中62种农药残留

张 瑶， 马桂娟， 高 琳， 王紫昕， 吴龙国

(1. 宁夏食品检测研究院（国家市场监管重点实验室（枸杞和葡萄酒质量安全）），宁夏 银川 750021;2. 宁夏大学，宁夏 银川 750021)

0 引 言

黄瓜种植过程中易多发生病菌感染及病虫害[1]，目前主要通过喷洒农药进行防治。由于部分病虫害抗药性增强，为提高黄瓜产量，大量使用多种农药进行防治，造成黄瓜农药残留严重，影响其质量安全。且部分农户在喷洒农药后安全间隔期不足即采摘上市，致使黄瓜中农药残留风险升高[2]。因此建立黄瓜中农药残留检测方法对于保障黄瓜产品质量安全，降低饮食的潜在风险具有现实意义。

目前，常规的农药残留常通过高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、高效液相色谱串联质谱法[5-9]、气相色谱串联质谱法[10]进行检测分析。气相色谱法和液相色谱法因其灵敏度低且在对多物质进行检测时难以达到完全分离，定性能力弱，易存在假阳性。由于色谱法存在上述不足，故而色谱与质谱联用技术逐渐广泛应用于多农残检测。液相色谱质谱法法虽具有高通量、高灵敏度的特点，但是由于部分农残（如菊酯类）不能检测，因此常与气质联用法互为补充。气相色谱-质谱联用技术具有高灵敏度、宽分离度、广泛的分析范围等优点，使得其在农药残留检测方面应用颇多[10-14]。目前，对于黄瓜中农药残留的气质法所测的种类均比较单一且农药数量较少[15-16]，黎宙等[17]利用液液微萃取及气质联用技术对黄瓜中9种有机磷进行检测；张志龙等[18]、白国涛等[19]均采用QUECHERS结合气质法对黄瓜种15种有机磷及菊酯类物质或10种杀菌剂进行检测。

本研究以设施黄瓜为研究对象，经调研确定了黄瓜生产中使用的62种农药，涵盖有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、醇类、醚类、酰胺类等多种杀虫剂、杀菌剂。采用气质联用结合固相萃取净化技术，同时优化程序升温条件，使得62种农药待测物在色谱柱中可达到完全分离。鉴于此点，对于气相色谱法检测多农残时难以完全分离从而产生的假阳性问题得到了解决，此方法亦可推广用于气相色谱检测。此外，实验前处理采用多种固相萃取小柱串接，更适合于成分复杂或颜色较深样本的检测，可减少杂质及基质影响，减少干扰，有利于待测物进行准确的定性定量，具有更强可操作性和较好的净化效果。该方法简便、快速、稳定性好，可推广用于基层检测机构中其他果蔬类多农药残留的检测与分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

GC/MS（7890B-7000C，安捷伦科技有限公司）；数显型分散机（IKAT25，德国IKA公司）；氮吹仪（HGC-24，北京恒奥德仪器仪表有限公司）； Envi-18柱（2 g/12 mL）, Envi-Carb（0.5 mg/6 mL）柱:美国色谱科；Sep-Pak (0.5 g/6 mL)：沃特世科技(上海)有限公司；旋转蒸发仪（ BUCHI V-850，瑞士步琦实验室实验室公司）；电子天平（BS 224，赛多利斯科学仪器公司）；高速离心机（K3-15，德国 Sigma 公司）。

1.1.2 试剂

丙酮（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；无水硫酸钠（分析纯）；正己烷（色谱纯）；62种农药中英文对照名称见表1。均购于农业农村部环境保护科研监测所。

1.2 气相色谱-质谱条件

1.2.1 气相色谱条件

弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）DB-1 701 ，载气为高纯氦气，初始体积流量 1.2 mL/min；不分流进样；升温程序：初始温度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 130 ℃，以5 ℃/min 升至 250 ℃，以 10 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。

1.2.2 质谱条件

GC-MS接口280 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆质量分析温度150 ℃，进样量1 μL。

1.3 样品处理

称取20.00 g(精确至0.01 g)黄瓜于100 mL离心管中，加入乙腈40 mL，置于离心机中10 000 r/min匀浆1 min，然后加入5 g氯化钠于离心管中，再10 000 r/min匀浆提取1 min，离心4 000 r/min离心5 min，取20 mL上清液待净化。将Envi-18柱经活化后，加入提取液并用15 mL乙腈洗涤柱，收集所有流出液于40 ℃旋转蒸发至1 mL，过经5 mL乙腈+甲苯（3+1）溶液活化的Envi-Carb与Sep-Pak的串接柱，并分3次用2 mL乙腈+甲苯（3+1）洗涤鸡心瓶，用25 mL乙腈+甲苯（3+1）淋洗，收集所有洗脱液，于40 ℃旋转蒸发至1 mL，于 35 ℃下氮气吹干，2 mL正己烷溶解残渣，经微孔滤膜（0.2 μm）过滤，用气相色谱质谱联用仪测定。

1.4 标准曲线

将配制的标准品用正己烷配置成10 μg/mL的混合标准储备液，储存在–4℃冰箱中备用。根据实验需要稀释成不同浓度的标准工作溶液，上机测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

一般而言，未能有效分离的化学物，即使色谱峰重叠，但由于定性、定量离子的差异性，最终也可以获得质谱分离，从而进行准确定量。但是合理的程序升温条件，可使多种化合物得以分离，亦能推广应用于气相色谱法。本文优化了程序升温条件，使用了4种不同的程序升温条件。程序1：设置初始温度为60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。程序2：初始温度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保持5 min。程序3：初始温度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 120 ℃，以5 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。程序4：初始温度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 130 ℃，以5 ℃/min 升至 250 ℃，以 10 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。经多种升温方式比较，程序4最为合适此62种农药的分离。程序1和程序2不能很好地将待测化合物进行分离，程序3分离时间较长，在大批量做样时，不利于节省时间，故选择程序4作为程序升温条件。结果如图1所示。

图1 62种农药混合标准溶液总离子流图

由图1可知，62种农药混合标准溶液可以在33 min之前全部出峰，且均可以得到较好的分离，以各物质响应最高且无基质干扰的离子做定量离子，以响应较高的离子作为定性离子，可对物质进行定性、定量检测。

2.2 优化前处理条件

2.2.1 溶剂的筛选

根据相似相溶的原理，大部分农药为有机农药，所以其易溶于乙酸乙酯、乙腈、丙酮。因试验对比发现，经丙酮提取，有机相颜色较深，可能是丙酮将试样本身携带的色素提取较多，对测定产生的干扰较强，并且分层效果不明显，盐析效果不如乙腈。使用乙酸乙酯进行提取，虽然大部分回收率符合回收要求，但提取液中的杂质较多，对后续分析干扰较大。以乙腈作为提取溶剂，可以减少黄瓜中色素的提取量，并且绝大多数农药的回收率处于合理范围。另外加入氯化钠，经匀浆和高速离心后，一方面使有机相与水相更好地分离，另一方面可使黄瓜中的糖分、有机酸等杂质溶于水，降低杂质的干扰，从而提高各待测化合物回收率，因此本文选择乙腈作为提取溶剂。用含有石墨化碳黑的小柱处理农残样品时，有些分子结构是平面的农药会被石墨化碳黑吸附，很难洗脱，导致回收率低[20]。在洗脱SPE小柱过程中，甲苯可以将其从SPE柱中洗脱下来，以提高平面分子结构农药的回收率。故经实验发现采用乙腈+甲苯（3+1）作为洗脱液，要优于用乙腈、正己烷+乙酸乙酯（1+1），可提高样本回收率。

2.2.2 固相萃取柱的选择

固相萃取柱主要的作用是选择性吸附与洗脱，去除杂质。C18柱具有强疏水性，主要用于去除脂类，对非极性的组分有极强的吸附作用。GCB柱适用于去除色素、甾醇类等干扰。Sep-Pak固相萃取柱能与部分官能团的分子形成氢键，可有效去除磺酸根离子等阴离子，同时能够吸附目标待测物，提高目标化合物回收率。以此，本实验选择了C18、GCB、Sep-Pak作为净化用固相萃取柱。

2.2.3 基质效应

由于样品基质中存在部分共提取物组分，这些组分对待测化合物的测定精确度存在一定的影响，从而形成了基质增强或减弱的效应。主要表现为基质标液与同浓度的纯溶剂标液相比，具有更高或更低的响应值。

式中：ME——基质效应；

Km——基质标准曲线的斜率；

Ks——溶剂标准曲线的斜率。

当 ME＜0时，表现为基质抑制效应，当 ME＞0，表现为基质增强效应。当ME＜20%时，表现为弱基质效应，可忽略不计；20%＜ME＜50%时，表现为中等基质效应；ME＞50%时表示基质效应增强。在气质常常表现为基质增强效应，为了避免基质效应对定量的影响，本实验采用基质标准曲线进行定量。

2.2.4 标准曲线、线性范围及检出限

由于基质中的杂质会对目标化合物离子的定量测定产生干扰，因此提取空白基质作为对照。使用正己烷分别将配制的62种农药标准储备液稀释成10.0 μg/mL混合标准溶液，然后用空白基质将混合标 准 溶 液 配 置 成20，50，100，200，500，750，1 000 ng/mL的标准工作液，经气相色谱质谱联用仪测定。采用空白样品添加方式考察62种农药的检出限（S/N=3），根据不同农药测定的峰面积和对应的浓度分别制作标准曲线，采用外标法进行定量，结果见表1。

表1 62种农药的质谱分析参数、线性回归方程及检出限

续表1 62种农药的质谱分析参数、线性回归方程及检出限

由表1可知：62种农药的保留时间范围为7～33 min之间，r2在0.966 0～0.999 2之间，可能是基质影响了样品的离子化，且对不同浓度样品影响不同，因此各物质的线性相关系数存在一定的差异性。检出限为0.03～20 μg/kg，可满足日常检测所需。

2.3 回收率和精密度

方法的准确度和精密度分别用添加回收率和添加回收率的标准偏差（RSD）进行评价。在空白黄瓜基质样品中进行0.02，0.08，0.15 mg/kg 3个水平的添加回收试验，每个水平6次重复，按建立的方法和色谱条件进行样品处理和测定，计算不同添加水平下的回收率和相对标准偏差（RSD），结果如表2所示。

由表2可知，不同添加水平下，同种农药的回收率存在一定差异。农药化合物的加样回收率范围主要集中在60.0%～120.0%之间，RSD为1.3%～15.3%；在低水平的加标回收中存在回收率大于130.0%或小于60.0%的现象，这主要是由于样品在质谱离子化过程和离子传输过程中的复杂环境，容易受到样本本底及杂质干扰、自身极性、稳定性等理化性质的影响存在一定的定量偏差。

表2 62种农药不同添加水平的回收率和精密度

续表2 62种农药不同添加水平的回收率和精密度

2.4 实际样品的检测

本文通过优化的方法对21批次的黄瓜中62种农药进行检测，如表3所示。其中己唑醇检出率最高为14.3%，检出量最高为0.036 mg/kg，溴螨酯检出率为9.5%，最高检出量为0.041 mg/kg，甲氰菊酯、速灭磷等检出率均低于5%，且检出量都不高，参照GB 2763—2021《食品安全国家标准》，均低于标准中规定的最大残留量。经研究以上几种农药分别为广谱杀菌剂，杀虫剂，可用于治疗黄瓜白粉病、茶黄螨、跗线螨、红蜘蛛等。

表3 黄瓜中农药的检出结果

3 结束语

本文利用气相色谱串联质谱法结合固相萃取技术，优化前处理、确定了最佳的质谱条件及程序升温方式，对黄瓜中62种农药残留进行检测。同时考察了方法的线性、不同水平的回收率、检出限与精密度等参数，并以实际样品进行检测进行验证。根据前期实验基础发现，此方法净化效果好，特别适合颜色较深、基质相对复杂的样品，且操作简便、灵敏度较高，具有良好的准确度和精密度，可用于大批量样品的快速检测。对其他蔬菜、水果、粮谷类等农产品中农药残留检测提供一定的参考价值。