基于网络药理学和实验验证探讨益气和血方治疗肝硬化的作用机制

张莹雪，孙凤霞，李晓玲，徐春军，郭雨菲，陈紫梦

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院感染科，北京 100010）

肝硬化是由各种因素导致慢性肝损害的一类晚期肝纤维化疾病［1］，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化、增殖是肝纤维化发生的中心环节，与多个信号转导通路有关［2，3］。全世界每年约有200 万人死于肝病，100 万人死于肝硬化并发症，肝硬化目前是全球第11 个最常见的死亡原因，给全球带来严重卫生经济负担［4］。肝硬化的治疗目前主要是病因治疗，抗炎抗肝纤维化，积极防治并发症，如果肝脏严重受损，治疗的唯一可能选择是肝移植［5，6］。中医药在治疗肝硬化中发挥了独特优势，尤其在抗肝纤维化方面得到普遍关注与认可，成为治疗肝硬化的重要手段之一［7］。

北京中医医院关幼波教授认为，疾病的发生及其发展、转归离不开气血这个主题，肝硬化以气虚血滞为本，慢性肝病久病体虚，首先要注重气血，活血化瘀，化瘀要软坚。因此，肝硬化治疗应以益气和血、养血柔肝、软坚散结为基础［8，9］。北京中医医院肝病科长期秉承关幼波教授“气血辨证”的学术思想，采用益气和血软坚散结法，拟方益气和血基础方，应用益气和血方加减治疗肝硬化患者，取得了显著的疗效，并积累了丰富的临床经验。本研究拟通过网络药理学及动物实验研究，探讨益气和血方可能的抗肝硬化机制。

1 材料与方法

1.1 益气和血方有效成分及靶点的获取

利用TCMSP 数据库，分别检索黄芪、当归、白芍，设置OB≥30%，DL≥0.18。利用BATMANTCM 数据库，检索鳖甲、鸡内金，设置score cutoff ≥20，校正后P＜0.05，筛选得到有效化合物及其作用靶点。然后应用“PERL”软件对所获得的药物成分及作用靶点进行合并，并应用Uniprot 校正靶点蛋白为规范的基因名称。

1.2 肝硬化的相关基因的获取

以“cirrhosis”为关键词，分别从GeneCard、PharmGkb、OMIM、DrugBank、TTD 数据库对肝硬化相关基因进行搜索。应用R×64 4.0.2 软件中的“venn”安装包以及脚本将结果取并集，绘制韦恩图。

1.3 获取潜在靶点

利用R 软件将药物活性成分相关的靶点和疾病靶点取交集，并绘制韦恩图，获得益气和血方活性成分的潜在治疗肝硬化作用靶点。

1.4 构建“药物活性成分-疾病靶点”调控网络图

首先将1.1 与1.2 最终获得的数据通过“PERL”软件以及脚本进行整理，然后应用Cytoscape 3.8.0软件构建“药物成分-疾病靶点”的网络图。节点的degree 值越大，则提示其参与生物功能越多。

1.5 构建蛋白互作网络

将交集基因导入到STRING 数据库中，设置物种条件为人，置信度＞0.9，构建蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）。将结果导入Cytoscape，采用cytoHubba 插件中的MCC 算法得到hub 基因。

1.6 KEGG 通路富集分析

利用R 软件对交集基因进行id 转换，并进行KEGG 通路富集分析。将P值过滤条件及校正后的过滤条件均设为0.05，从KEGG 通路富集结果中选定后续进行实验验证的通路，并绘制通路图。

1.7 实验验证

1.7.1实验动物 SPF 级SD 雄性大鼠35 只，6 周龄，体质量（200±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0011。动物实验经北京市中医研究所实验动物管理委员会批准（伦理号2021030102）。

1.7.2主要试剂与仪器 四氯化碳（CCl4），for HPLC，≥99.0%（上海麦克林生化科技有限公司）；HE 染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；Masson染色液由实验室配制；RNA 提取试剂盒（赛默飞，PureLinkTMRNA Mini Kit）；一步法荧光定量RTPCR 试剂盒（096A）（TaKaRa）；荧光定量PCR 仪（Roche 德国，型号：LightCycler 480 Ⅱ）。

1.7.3 中药制备 益气和血方由生黄芪30 g、当归12 g、白芍15 g、醋鳖甲15 g、醋鸡内金10 g 组成，在临床使用中，一日一副。购于首都医科大学附属北京中医医院。大鼠灌胃剂量参照《药理实验方法学》［10］，按照成人与大鼠的给药剂量换算系数折算成大鼠用量，剂量为0.861 g/100 g。

1.7.4 大鼠造模及给药 造模参考相关文献［11，12］并进行改良，35 只大鼠适应性喂养3 d 后，随机选取3 只大鼠作为空白组，其余32 只造模组大鼠以50% CCl4溶液（溶剂为橄榄油）2 mL/kg 的剂量进行腹腔注射2 周，3 mL/kg 注射4 周，每周均2 次，所有大鼠自由饮水和摄食。造模共6 周后，随机选取造模组3 只，通过病理检测评估造模成功后，将其随机分为模型组、益气和血方组，每组各10 只。中药组给予益气和血方中药灌胃，其余大鼠予等量生理盐水灌胃，所有大鼠每日灌胃1 次，给药容量：1 mL/100 g，连续给药4 周。

1.7.5 病理标本的采集 予戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠固定，剖开腹腔，切取大鼠肝脏，取同一位置的肝脏组织，置于4%多聚甲醛溶液，再取多块肝脏组织于液氮中迅速冷冻，将所有样品保存于-80 ℃冰箱，以便于后期RT-qPCR 检测。

1.7.6 指标检测 （1）每组各取3 只，进行HE 染色与Masson 染色，观察肝组织病理学变化；（2）每组各取3 只，RT-qPCR 法 测 定 肝 组 织JAK2、STAT3mRNA 表达水平。按照试剂盒说明书提取各组大鼠肝组织中总RNA 并合成cDNA，进行RT-qPCR分析。 引物序列：JAK2上游引物5' - ATGCTTCCTGTATTCACCTGCCTTG-3'，下 游 引物5' - GCTCCTGCCCTTTCATTCCTCTG - 3'，STAT3上游引物5'-CGGTTCAGTGAGAGCAGCAAGG-3'，下 游 引 物5'-AGTGAGACAAGAGGAGCAGGTGAG-3'。

1.8 统计学处理

所得数据应用GraphPad Prism 8.0.2 软件和SPSS 26.0 软件进行统计分析及作图。实验结果数据均采用均数±标准差表示，若方差齐则多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益气和血方有效成分筛选与靶点预测

共获得43 个有效成分，其中白芍13 个，当归2个，黄芪20 个，鳖甲1 个，鸡内金7 个；同时共获得1 081 个预测靶点。将有效成分及靶点预测文件采用“PERL”软件及其脚本进行合并，然后应用Uniprot 数据库及“PERL”软件进行标准化注释、整理，最终获得648 个靶点。

2.2 肝硬化相关基因

通 过GeneCard 数 据 库、OMIM 数 据 库、PharmGkb 数据库、TTD 数据库、DrugBank 数据库分别获得肝硬化相关靶基因3 158 个、9 个、1 个、23 个、86个，经整理后共获得3 220 个肝硬化相关靶基因（图1）。

图1 肝硬化相关靶基因图Fig 1 Map of target genes related to liver cirrhosis

2.3 药物靶点与疾病靶点基因交集

经过整理、分析共获得药物潜在活性成分靶点648 个，疾病靶点3 220 个，两者得出的交集基因为306 个（图2）。

图2 益气和血方和肝硬化相关靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of Yiqi Hexue Formula common target related to liver cirrhosis

2.4 “活性成分-核心靶点”网络分析

活性成分-核心靶点图中共有336 个节点，其中来源于化合物的有30 个，来源于基因的有306 个（图3）。将degree 排前10 的有效成分列出（表1）。

图3 “活性成分-核心靶点”网络图Fig 3 Network diagram of"active ingredients-core targets"

2.5 蛋白互作网络图构建

将交集基因导入到STRING 数据库，构建PPI网络。将PPI 网络导入Cytoscape，根据MCC 值对节点进行有序排列，前10 个靶点依次为JUN、RELA、IL6、IL1B、CXCL8、IL1A、CCL2、IL4、TP53、IL10（图4、5），推测这些靶点是益气和血方治疗肝硬化的关键靶点。

图4 益气和血方治疗肝硬化的PPI 网络Fig 4 PPI network of Yiqi Hexue Formula in the treatment of liver cirrhosis

2.6 KEGG 通路富集分析

经过KEGG 通路富集分析共得到180 条通路富集 结 果，涉 及PI3K/Akt、MAPK、IL-17、JAK/STAT 等信号通路等。见图6。提示益气和血方可能通过以上通路发挥对肝硬化的治疗作用。

图5 益气和血方治疗肝硬化的hub 基因（Top10）Fig 5 Hub gene（Top10）of Yiqi Hexue Formula in the treatment of liver cirrhosis

图6 JAK/STAT 信号通路（红色边框代表共同基因）Fig 6 JAK/STAT signaling pathway（red borders represent common genes）

2.7 实验验证

2.7.1 模型评估 造模结束后，HE 染色及Masson染色结果显示：空白组无明显炎性细胞浸润，肝细胞索呈放射态整齐排列，小叶结构完整。模型组可见肝细胞坏死，炎细胞浸润，脂肪变性严重，肝细胞索排列混乱，弥漫性纤维增生，假小叶形成。见图7、8。

图7 大鼠肝脏组织HE 染色（×200）Fig 7 HE staining of rat liver tissue（×200）

图8 大鼠肝脏组织Masson 染色（×200）Fig 8 Masson staining of rat liver tissue（×200）

2.7.2 益气和血方对肝硬化大鼠肝组织病理改善 治疗结束后，HE 染色及Masson 染色结果显示，空白组肝细胞索排列整齐，无明显炎性细胞浸润。模型组可见肝小叶结构损害，部分尚可见肝细胞脂肪性变，炎细胞浸润。与模型组相比，益气和血方组肝纤维化程度明显减轻，纤维着色明显变淡，炎性细胞浸润现象减少，肝细胞散在脂肪空泡。见图9、10。

图9 大鼠肝脏组织HE 染色（×200）Fig 9 HE staining of rat liver tissue（×200）

图10 大鼠肝脏组织Masson 染色（×200）Fig 10 Masson staining of rat liver tissue（×200）

2.7.3 各组大鼠肝组织JAK2、STAT3mRNA 表达比较 与空白组比较，模型组JAK2、STAT3mRNA 表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，益气和血方组JAK2、STAT3mRNA 表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图11。

图11 各组大鼠肝组织JAK2、STAT3 mRNA 表达比较Fig 11 Comparison of JAK2 and STAT3 mRNA expression in liver tissues of rats in each group

3 讨论

本课题组前期在益气和血方治疗肝硬化方面积累了一定的研究基础，研究发现，益气和血方联合恩替卡韦片治疗乙肝肝硬化有助于改善患者中医证候积分，减轻肝脏炎症，改善肝脏合成储备功能，改善脾脏大小、门脉宽度，降低Child 评分，提高再代偿率等，临床疗效确切［13-15］，但其具体机制尚不清楚。网络药理学可初步预测中药的作用机制，在中药领域有着广泛的应用［16］。本课题拟采用网络药理学研究益气和血方的多种活性成分，探讨益气和血方治疗肝硬化的作用机制，进而采用动物实验对网络药理学预测出的信号通路加以验证。

本研究发现益气和血方中关键化合物主要为胆汁三烯、槲皮素、烟酸、山奈酚、维生素C 等活性成分。其中胆汁三烯是鸡内金的主要化学成分之一［17］，通过活性成分-核心靶点分析，发现胆汁三烯作用靶点包括PDGFB、SCNN1A、KCNJ8 等，具体机制有待进一步验证。槲皮素是一种多酚类黄酮，研究发现槲皮素能够抗CCl4 诱导的肝纤维化［18，19］。通过网络药理研究发现槲皮素的作用靶点包括PTGS1、PTGS2、JUN、STAT1、AKT1、IL6R 等，相关作用机制研究发现槲皮素等黄酮类化合物能干预与肝纤维化发生密切相关的信号通路［20］。网络药理研究表明烟酸与PPARA、IL13、IL6、MAPK9、TP53 等靶点密切相关，姜黄素与烟酸联合用药可明显降低肝脏TNF-α、IL-6 的表达［21］。烟酸可以通过 调 节PPARα、DGAT2、SREBP1cmRNA 的 表达，明显改善肝细胞脂肪变性及纤维化［22］。山奈酚的 作用 靶 点 包括STAT1、JUN、MMP1、MAPK8等，体外实验表明山奈酚可显著抑制HSC-T6 细胞的增殖，且作用较强［23］；体内实验表明山奈酚有抗纤维化疗效，其作用机制可能是通过下调IL-13和COL1的mRNA 表达，抑制胶原合成，以及上调MMP-2的mRNA 表达促进胶原分解［24］。研究表明抗氧化剂维生素C 可能通过抑制瘦素诱导的氧化应激，从而抑制HSC 增殖［25］，临床研究发现维生素C联合微生态制剂，有助于改善肝硬化患者的肝功能、肝纤维化指标等［26］。

关于KEGG 通路富集，主要涉及PI3K/Akt、MAPK、IL-17、JAK/STAT 等 信 号 通 路。PI3K/Akt 信号通路参与肝纤维化的形成，主要与调控细胞外基质的降解、干预HSC 的活化等相关［27］。MAPK 信 号 通 路 与 肝 纤 维 化 密 切 相 关［28］，其 中ERK/MAPK 信号通路参与了HSC 的增殖、分化和迁移［29］，JNK 和p38 可以调节纤维形成过程中细胞的分化［30］。IL-17 通过多种机制诱导肝纤维化，如促进炎症细胞产生IL-6、IL-1β 和TNF-α，并能增加TGF-β1 的表达，还可以通过激活STAT3 信号通路直 接诱导HSC 产生I 型胶原［31］。JAK/STAT 信号通路广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及炎症等过程，对肝纤维化形成过程中的瘦素、IL-4、IFNα 发挥着重要的调节作用［32］。JAK2 和STAT3，在该通路的信号转导中有着重要的地位［33，34］，相关研究表明，一些细胞因子与HSC 细胞膜受体结合后，激活JAK2/STAT3 通路，暴露出核定位信号，STAT3 进入HSC 胞核，与DNA 上的特定调节序列结合并启动其转录，使HSC 增殖，促进肝纤维化形成［35，36］。但查阅大量文献，关于肝硬化/肝纤维化与经典的JAK2/STAT3 信号通路的研究相对较少，结合网络药理学结果，本研究选择该通路进行验证，探讨益气和血方治疗肝硬化的部分作用机制。研究结果显示：模型组肝组织JAK2、STAT3mRNA 表达显著上调，说明JAK2/STAT3 信号通路参与肝硬化的形成，益气和血方治疗组JAK2、STAT3mRNA的表达较模型组明显下调，表明益气和血方抑制JAK2、STAT3的表达。

综上，本研究采用网络药理学和动物实验研究益气和血方治疗肝硬化的作用机制，网络药理学发现益气和血方能够通过多成分、多靶点、多条通路达到治疗肝硬化的目的，为进一步从益气和血方中提取有效活性成分治疗肝硬化提供了理论依据，实验验证表明JAK2/STAT3 信号通路参与肝硬化的形成，益气和血方对治疗肝硬化有明确疗效，能够改善其病理表现，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3 信号通路传递有关。

作者贡献度说明：

张莹雪：构思研究，完成网络药理学分析，参与实验设计、执行和数据统计。孙凤霞：写作审查和监督做出了贡献。李晓玲、徐春军：执行数据分析。郭雨菲、陈紫梦：参与实验执行。所有作者设计实验、撰写并修改论文。

所有作者声明本论文的发表不存在利益冲突。