HPLC-QAMS 法同时测定癫痫康胶囊中10 种成分含量

关丽文，张 爽，高鑫磊，杨天明

（1. 海南省肿瘤医院临床药学部，海南 海口 570100；2. 海南省肿瘤防治中心，海南 海口 570100；3. 海南省海口市制药厂有限公司质量管理部，海南 海口 570100；4.广东食品药品职业学院中药学院，广东 广州 510520）

癫痫是神经内科常见的以脑神经异常放电为主要临床特征的慢性脑部疾病，可能导致患者永久性脑损伤，甚至死亡。癫痫康胶囊由天麻、远志、麦冬、石菖蒲、僵蚕、丹参等15 味中药材配伍组方，具有镇惊熄风、化痰开窍的功效，主要用于治疗风痰闭阻、痰火扰心、神昏抽搐、口吐涎沫的癫痫患者。现代研究表明癫痫康胶囊联合丙戊酸钠缓释片可降低癫痫患者脑组织中肿瘤坏死因子-α、白介素-6和血清因子水平，从而改善患者临床症状，降低炎性因子水平［1］；癫痫康胶囊还可提高后期病情控制质量，改善患者的精神状态［2，3］；其联合左乙拉西坦可降低癫痫患者血清S-100β 蛋白、超敏C-反应蛋白和丙二醛水平，改善其生活能力和智力水平，还可升高α、β 波段脑电相对功率、降低δ、θ 波段脑电相对功率，有效改善其神经功能［4-7］。癫痫康胶囊现行质量标准［8］及其相关文献［9，10］仅对一种成分的含量进行测定，不能客观评价癫痫康胶囊的内在质量，更不能确保其临床有效性。 HPLC-QAMS 法利用中药所含成分间的内在函数和比例关系，通过测定质量稳定、价廉易得的某一成分实现多指标成分的同步检测，现已广泛应用于中成药复方制剂的质控。本实验以癫痫康胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚为定量控制指标，涵盖了处方中4 种中药材所含的10 种代表性成分，以细叶远志皂苷为内参物，计算其与天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚的相对校正因子（fk/s），通过fk/s计算各成分含量，与外标法实测值对比，考察两种方法的差异。该方法降低了检验成本，缩短了检验周期，利于方法的推广普及，可为全面控制癫痫康胶囊内在整体质量提供数据支撑。

1 资料与方法

1.1 一般资料

癫痫康胶囊（每粒装0.3 g）来源于广盛原中医药 有 限 公 司（批 号2006052、2007072、2007083、2010091、2010102、2101013、2101022、2103012、2104030、2105032、2105034 和 2109043，编 号：S1～S12）；对照品天麻素、细叶远志皂苷和β-细辛醚（ 批 号 110807-202010、 111849-202106 和112018-201802，纯度95.5%、97.3%和99.3%）来源于中国食品药品检定研究院；对照品麦冬甲基黄烷酮A、巴利森苷E、巴利森苷B、甲基麦冬二氢高异黄酮B、巴利森苷、远志皂苷B 和α-细辛醚（批号PRF9102924、 PRF9010943、 PRF9061142、PRF9102925、 PRF9061141、 PRF8112741 和PRF8051843，纯度98.9%、98.4%、97.2%、98.9%、97.6%、98.7%和99.2%）来源于成都普瑞法科技开发有限公司；色谱级乙腈，其余试剂为分析纯。安捷伦高效液相色谱仪（安捷伦公司，型号：1260 型）、岛津高效液相色谱仪（岛津仪器有限公司，型号：LC-20A 型）；电子天平（瑞士梅特勒托利多公司，型号：AB265-S 型）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，型号：KQ-300VDY 型）；Waters Symmetry C18柱、Phenomenex Nucleosil C18柱 和 迪 马Spursil C18柱，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 方法

1.2.1对照品溶液配制 精密称取对照品天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚各适量，用50%甲醇溶解并稀释，制成每毫升含0.978、1.130、0.356、2.492、3.810、4.594、0.292、0.118、5.874 和1.856 mg 的混合对照品贮备液。贮备液用50%甲醇稀释20 倍制得10 种成分质量浓度分别为48.9、56.5、17.8、124.6、190.5、229.7、14.6、5.9、293.7 和92.8 μg/mL 的混合对照品溶液。

1.2.2供试品溶液配制 精密称定癫痫康胶囊内容物2 g，加50%甲醇20 mL，KQ-300VDY 型超声波清洗器超声提取45 min 后，放冷，以相同溶剂定容至25 mL，过滤（0.45 μm），续滤液即为癫痫康胶囊供试品溶液。取按处方工艺制备的缺天麻、缺远志、缺麦冬、缺石菖蒲的阴性供试品，按上述方法制备阴性供试品溶液。

1.2.3色谱条件 乙腈（A）-0.05%磷酸为流动相，梯度洗脱（0～10 min，17.0%A；10～24 min，17.0%→26.0%A；24～37 min，26.0%→58.0%A；37～48 min， 58.0%→72.0%A； 48～70 min， 72.0%→17.0%A）；安捷伦1260 型高效液色谱仪；Waters Symmetry C18柱，色谱柱柱温30 ℃；检测波长220 nm（0～37 min，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B）［11-16］、296 nm（37～48 min，麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异 黄 酮B）［17，18］和275 nm（48～70 min，β-细 辛 醚、α-细辛醚）［19-22］；流速1.0 mL/min，进样量10 μL。按细叶远志皂苷计时理论板数应不低于5 500。

2 结果

2.1 专属性试验

取对照品溶液及供试品溶液适量依法进样检测，记录色谱流出曲线（图1）。结果可知癫痫康胶囊供试品溶液中1～10 号色谱峰与相邻杂质峰能够有效分离，拖尾因子符合现行版中国药典规定；阴性供试品对癫痫康胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚定量分析无干扰。

图1 HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 线性范围考察

精密吸取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分别用50%甲醇定容至20 mL 制得6个系列浓度的线性溶液（Ⅰ～Ⅵ），在上述色谱条件下检测，以天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚对照品质量浓度与峰面积进行线性回归，见表1，可知各成分在各自范围内具有良好的线性关系。

表1 10 个对照品的线性关系和范围Tab 1 Regression equations and linear ranges of ten reference substances

2.3 精密度、重复性与稳定性实验

取癫痫康胶囊（编号：S1），依法制备供试品溶液1 份，在上述色谱条件下重复进样6 次，记录流出色谱曲线图，测得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚峰面积相对标准偏差（relative standard deriation，RSD）值依次为1.25%、1.10%、1.37%、0.82%、0.76%、0.62%、1.47%、1.59%、0.53%和1.01%。

取癫痫康胶囊（编号：S1），依方法制备供试品溶液6 份，在上述色谱条件下进样，记录流出色谱曲线图，采用外标法计算天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细 辛 醚 含 量 平 均 值 分 别 为0.816、0.943、0.281、1.860、2.716、3.531、0.221、0.098、4.395、1.404 mg/g，再计算得10 种成分含量的RSD 值依次为1.57%、1.51%、1.79%、1.13%、1.06%、0.99%、1.80%、1.88%、0.87%和1.36%。

取癫痫康胶囊（编号：S1），依法制备供试品溶液1 份，于制备后0、3、6、10、16、24 h 在上述色谱条件下检测，记录流出色谱曲线图，结果可知癫痫康胶囊供试品溶液24 h 稳定，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚峰面积RSD 值依次为1.31%、1.14%、1.35%、0.85%、0.78%、0.59%、1.50%、1.62%、0.54%和1.03%。

2.4 加样回收实验

精密称取癫痫康胶囊（编号：S1）内容物1 g，取9 份，均分成3 组，精密加入混合对照品溶液（10 种对照品的质量浓度依次为0.816、0.941、0.282、1.849、2.706、3.524、0.229、0.097、4.412 和1.395 mg/mL）0.8、1.0 和1.2 mL，依法制成加样供试品溶液。在上述色谱条件下进样，记录流出色谱曲线图，得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚的平均加样回收率及RSD 值，分别为99.01%（0.92%）、98.89%（1.01%）、97.03%（0.76%）、99.29%（1.14%）、98.56%（0.87%）、100.10%（0.62%）、96.96%（1.50%）、97.94%（1.55%）、100.06%（0.73%）和99.82%（0.51%），结果见表2，该方法具有良好的准确度。

表2 癫痫康胶囊中10 种成分的加样回收试验（n=9）Tab 2 Recoveries of ten constituents in Dianxiankang Capsules（n=9）

续表

2.5 相对校正因子（fk/s）的确定及耐用性考察

2.5.2 仪器和色谱柱对fk/s的影响 分别用Waters Symmetry C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）、Phe-校正因子、质量浓度和峰面积，k 和s 分别为内参物、其他待测成分）计算各成分的fk/s，分别为0.823 8、0.723 9、1.022 9、1.188 1、0.727 2、1.310 8、0.931 4、0.654 9 和1.057 2，RSD＜2.0%，结果见表3，表明建立的相对校正因子准确可行。

表3 癫痫康胶囊中各成分的fk/sTab 3 fk/s of each component for Dianxiankang Capsules

nomenex Nucleosil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）和迪马Spursil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），考察安捷伦1260 型和岛津LC-20A 型高效液相色谱仪对fk/s的影响，取1.2.1 项下混合对照品溶液进样，记录流出色谱曲线图，以细叶远志皂苷（5 号峰）为内参物，计算其他9 种成分的fk/s，分别为0.824 5、0.725 8、1.018 1、1.184 5、0.724 6、1.308 3、0.926 5、0.655 1 和1.055 0，RSD＜2.0%，结果见表4，表明相对校正因子对仪器和色谱具有良好的适用性。

表4 不同仪器及色谱柱对fk/s的影响Tab 4 Effects of instruments and columns on fk/s

2.5.3 流速对fk/s的影响 流速：0.8、1.0 和1.2 mL/min，取1.2.1 项下混合对照品溶液进样，记录流出色谱曲线图，以细叶远志皂苷（5 号峰）为内参物，计算各成分的fk/s，分别为0.825 5、0.722 0、1.024 0、1.191 6、0.725 9、1.317 6、0.934 4、0.656 5 和1.059 5，RSD＜2.0%，结果见表5，表明相对校正因子对流速具有良好的适用性。

表5 流速对fk/s的影响Tab 5 Effects of flow velocity on fk/s

2.5.4 柱温对fk/s的影响 柱温：25、30 和35 ℃，取1.2.1 项下混合对照品溶液进样，记录流出色谱曲线图，以细叶远志皂苷（5 号峰）为内参物，计算各成分的fk/s，分 别 为0.822 8、0.723 8、1.023 4、1.187 3、0.725 8、1.308 3、0.925 7、0.650 9 和1.055 8，RSD＜2.0%，结果见表6，表明相对校正因子对柱温具有良好的适用性。

表6 柱温对fk/s的影响Tab 6 Effects of column temperatures on fk/s

2.5.5 色谱峰定位 本实验用Waters Symmetry C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）、Phenomenex Nucleosil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）和迪马Spursil C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），在上述色谱条件下，采用安捷伦1260 型和岛津LC-20A 型高效液相色谱仪进样检测1.2.1 项下混合对照品溶液，记录色谱流出曲线及各成分对应保留时间，以细叶远志皂苷（5 号峰）为参照峰，采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，计算其他9 种成分的相对保留时间（ts/k＝ts/tk，k 为内参物，s 为待测组分）。计算各成分的ts/k，分别为0.384 9、0.576 6、0.652 7、0.717 4、1.117 5、1.327 6、1.476 2、1.737 7 和1.976 3，RSD＜2.0%，见表7，表明采用相对保留时间法可用于色谱峰定位。

表7 不同仪器及色谱柱对ts/k的影响Tab 7 Effects of instruments and chromatographic columns on ts/k

2.6 含量测定

取12 批癫痫康胶囊（编号：S1～S12），依法制备癫痫康胶囊供试品溶液，在上述色谱条件下进样，记录色谱流出曲线图，分别运用 ESM、HPLC-QAMS 法计算各成分含量（P＞0.5），表明两种方法无显著性差异，见表8。

表8 癫痫康胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚含量测定结果（mg/g，n=3）Tab 8 Determination results of gastrodin，parishin E，parishin B，parishin，tenuifolin，onjisaponin B，methylophiopogonanone A，methylophiopogonanone B，β-asarone and α-asarone in Dianxiankang Capsules（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 目标成分的选择

癫痫康胶囊由天麻、远志、麦冬、石菖蒲、人参、丹参、僵蚕、胆南星、全蝎、冰片、人工牛黄、琥珀、川贝母、淡竹叶和生姜组方，方中天麻和僵蚕息风止痉、祛风通络；石菖蒲化痰开窍醒神、益智化湿；胆南星清热化痰、祛风平惊，四药共为君药；丹参活血凉血、清心安神；人参大补元气、安神益智；人工牛黄、冰片开窍醒神、清热祛痰、熄风止痉；远志安神益智、开窍宁心；琥珀镇惊安神；全蝎息风止痉、通络散结，七味中药共为臣药；其余四味为佐使药。本实验以君药天麻和石菖蒲所含有效成分为主，兼顾臣药远志及佐药麦冬所含主要成分，选取天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚共10 种活性成分进行定量分析。同时考虑到细叶远志皂苷出峰时间居中，对照品质量稳定，故选择其作为内参比物质。

3.2 流动相的确定

曾以癫痫康胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚的分离效果为主考察指标，同时兼顾基线平稳情况，在乙腈-水、甲醇-水流动相条件下进行对比预实验，结果乙腈-水系统优于甲醇-水，但2 号峰和3 号峰分离不完全，不能正常积分。后采用乙腈-0.05%磷酸溶液［14，17］、乙腈-0.1%甲酸溶液［18］对比预实验，最终选取乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相，采用HPLC-QAMS 法对癫痫康胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚含量进行同时检测。

3.3 供试品提取方式的确定

曾以天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚的综合提取效果为考察指标，对比考察提取溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、70%乙醇［13］）及提取方式（超声提取、加热回流），优选最佳供试品制备方法，结果发现50%甲醇超声提取时10 种成分的综合提取效果最佳，通过对提取时间进行优化，最终确定1.2.2 项下的供试品制备方法。

本实验首次将HPLC-QAMS 法应用于癫痫康胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷、细叶远志皂苷、远志皂苷B、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、β-细辛醚和α-细辛醚多指标质量评价模式，避免了部分对照品不稳定、价格高的不足，选用稳定价廉且在癫痫康胶囊中含量适中的细叶远志皂苷为内参比物质，同时比较了外标法和HPLC-QAMS 法的含量测定结果差异。所建立的方法结果准确，简单易行，为癫痫康胶囊多指标综合质量控制奠定了基础。

作者贡献度说明：

关丽文：实验设计，撰写论文；高鑫磊、杨天明：负责实验数据的采集和分析；张爽：负责文章审校。

所有作者声明不存在利益冲突。