蛭龙活血通瘀胶囊治疗动脉粥样硬化的作用机制

龚莉焰，李双阳，杨思进，白 雪*

（1.西南医科大学，四川泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一类血管慢性炎症性疾病[1]，主要以他汀类药物治疗为主，长期服用存在肝肾损害风险。而中药毒副作用小，能整体调控患者脏腑功能，减轻临床症状，具有良好的研究前景。

AS尚无确切的中医病名，按照其发生部位及临床表现，可纳入“胸痹”、“中风”等范畴。《医林改错》言：“治病之要，在明白气血，……，所伤者无非气血”，提倡的补气活血化瘀法广泛用于胸痹、中风的治疗[2,3]。基于此理论研制的蛭龙活血通瘀胶囊对AS、缺血性脑卒中、冠心病等疾病均有不错疗效[4-6]，但具体作用机制尚不清楚，本文拟用网络药理学方法探讨蛭龙活血通瘀胶囊治疗AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物主要活性成分筛选

利用中药药理数据库TCMSP（https://tcmspw.com/）及相关文献检索蛭龙活血通瘀胶囊中大血藤、黄芪、人参、桂枝的主要活性成分（筛选标准：OB≥30%，DL≥0.18）。通过TCMID数据库（http://tcm.cmu.edu.tw/）检索水蛭的活性成分，并使用SwissADME进行筛选（筛选标准：GI absorption：HIGH，Druglikeness中至少2个YES）。

1.2 中药靶点的获取

将所得活性成分通过SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget-prediction.ch/）数据库进行靶点预测。筛选标准：同时满足3D相似性阈值设置为0.75、2D相似性阈值设置为0.45及Probability＞0。并利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行基因转换。

1.3 疾病靶点的选择

以“Atherosclerosis”为关键词在DisGeNET（https://www.disgenet.org/）与GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库检索疾病靶点信息。

1.4 中药复方—疾病靶点的获取

将1.2项及1.3项所得靶点输入Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）网址，获取药物与疾病的交集靶点及韦恩图，并利用Cytoscape3.9.0软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图。

1.5 PPI网络的构建

将交集靶点导入STRING11.0数据库（https://stringdb.org/）构建PPI网络图。设置条件：蛋白质种类“homo sapiens（人类）”，作用阈值 “medium confidence（0.400）”。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用CytoScape中Metascape组件对交集靶点进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，并使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）将富集结果可视化。

1.7 分子对接验证

在化源网（https://www.chemsrc.com/）中查找“药物-成分-疾病-交集靶点网络”中靶点数前三的药物化学成分的分子结构，并通过ChemBioDraw 14及ChemBio3D Ultra 14转化为 mol2 格式文件。筛选PPI网络中degree值前3的基因，从PDB数据库（https://www.rcsb.org）获取智人中适合的化合物蛋白晶体结构的3D分子结构pdb格式文件，再通过Auto Dock Tools 1.5.6软件转换为pdbqt格式。使用Auto Dock 4.2.6 软件进行分子对接、Pymol 2.4.1 软件进行对接结果可视化分析。

2 结果

2.1 活性成分

经TCMSP、TCMID及相关文献[7-9]筛选，共得蛭龙活血通瘀胶囊主要活性成分58个（去重后54个），其中大血藤5个、桂枝7个、黄芪21个（通过查阅文献获得黄芪总皂苷及黄芪多糖2种化学成分，虽然黄芪总皂苷不符合SwissADME筛选条件，但已有研究表明其具有降低氧化应激损伤，神经保护[8]，可改善AS小鼠脂代谢[9]，故也被纳入研究范畴）、人参19个、水蛭6个，包括黄芪总皂苷、黄芪多糖、山奈酚、槲皮素等。合并去重后中药靶点790个，疾病靶点182个，药物与疾病交集靶点61个（见图1）。

图1 蛭龙活血通瘀胶囊与AS交集靶点

2.2 中药有效成分-靶点网络图与疾病-成分-靶点网络图构建

利用Cytoscape3.9.0绘制“药物-成分-疾病-靶点”网络图，共有121个节点、442条边（见图2）。靶点数前三的化合物分别是槲皮素、山奈酚及花生四烯酸。

图2 药物-成分-疾病-交集靶点图

2.3 PPI网络构建

将61个交集靶点导入STRING11.0数据库构建PPI网络（已去除独立靶点：ABCC9）（见图3）。

图3 蛭龙活血通瘀胶囊治疗AS的PPI网络图

2.4 GO富集结果

对交集靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析，以count值为筛选依据，绘制GO Biological process（BP）、GO Cellular component（CC）及GO Mo-lecular function（MF）三合一柱形图（见图4）。结果表明，在生物过程方面，主要涉及炎症反应调节、防御反应调节、血管发育、细胞凋亡及细胞迁移的正调控等；在细胞组分方面，主要涉及膜侧、细胞外基质、质膜外侧、受体复合体等；在分子功能方面，主要涉及氧化还原酶活性、细胞因子受体结合、肽酶活性、转录因子结合等。

图4 BP、CC、MF三合一柱形图

2.5 KEGG富集结果

KEGG通路富集分析共获取101条通路，主要涉及AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、Apelin信号通路等。选取靶点数前20的信号通路绘制富集气泡图（见图5）。

图5 KEGG通路富集信息气泡图

2.6 分子对接结果

一般认为，结合能越小，代表配体与受体间相互作用的亲和力越强，发生作用的可能性越大。经筛选，靶点数前三的主要活性成分是槲皮素、山奈酚及花生四烯酸，degree值前三的靶点是IL6、TNF、AKT1。从上述化合物与交集靶点的分子对接结果（见附表）中不难发现，花生四烯酸与AKT1（PDB ID：1INQ）、槲皮素与TNF（PDB ID：2AZ5）、山奈酚与AKT1（1UNQ）均具有良好的结合活性。花生四烯酸可与活性位点附近的ASN-53、ARG-25、LYS-14、ARG-23四种氨基酸形成氢键结合到AKT1、槲皮素可与ASP-45、GLY-24、ILE-136三种氨基酸形成氢键结合到TNF、山奈酚可与GLN-47、GLU-40、LYS-39三种氨基酸形成氢键结合到AKT1上（见图6）。

附表 分子对接结果（kcal/mol）

图6 分子对接图

3 讨论

目前认为，AS与高血脂、高血糖等高危因素刺激机体，产生内皮细胞炎症损伤及功能失调所致局部斑块、血栓形成有关[10]，提倡采用降脂、抗氧化等治疗[11]。但长期用药会产生肝肾功能损害、肌肉毒性反应、血糖异常、脑卒中、胃肠道症状等不良反应[12,13]。我国作为AS患病人数最多的地区之一[14]，在中药防治由AS继发的胸痹、中风上有丰富的临证经验，在有效缓解症状的同时未增加不良反应。蛭龙活血通瘀胶囊由大血藤、黄芪、桂枝、人参、水蛭等五味中药组成，具有“补益气血，益气通络”之功，可通过改善血脂[5]、抗炎、抗细胞焦亡[15]、保护血管内皮[16]等达到治疗AS的作用。

利用网络药理学方法筛选出黄芪总皂苷、黄芪多糖、山奈酚、槲皮素等58个主要活性成分，可通过抗炎、抗氧化应激、抗细胞凋亡、保护血管内皮等作用抑制AS发生发展[17-20]。IL6、TNF、AKT1、PTGS2、VEGFA、CCL2、MMP9、IL1B、NOS3、SERPINE1作为核心度前10位的关键靶点，在AS的治疗中发挥了关键作用。VEGFA是VEGF家族中常见的一类亚型，具有维护内皮细胞完整、调控血管内皮细胞生成、修复受损血管的功能[21]。促炎因子IL6、IL1B与TNF可协同诱导VEGF的产生。VEGF与VEGFR的结合可促进AKT/PKB磷酸化，激活内皮细胞NOS3（eNOS）的表达[22]，促使内皮细胞分泌NO。NO不仅促进血管扩张、抑制血小板等物质与血管内皮的聚集粘附、抑制纤维斑块的形成，也能防止由促炎细胞因子和促动脉粥样硬化因子（如活性氧（ROS））诱导的内皮细胞凋亡[23,24]。趋化因子CCL2具有调控白细胞迁移及炎症细胞运输的作用，在AS病变血管内膜中显著表达[25]。 MMP-9具有降解细胞外基质的生理功能，可通过对Ⅳ、Ⅴ型明胶原的调控作用，加速动脉粥样斑块破裂及AS进程[26]。

AGEs是晚期糖基化过程产生的一类异质分子，参与体内多种生理病理过程，RAGE为其细胞受体。当机体受到高血糖、氧化应激、炎症反应等刺激时，AGEs产生增多。与内皮细胞表面的RAGE结合后，可刺激内皮细胞产生ROS并进一步激活核转录因子（NF-κB）的表达。NF-κB通过作用于相关信号通路，致使TNF-α、IL-6等炎性因子不断产生，损伤血管内皮，发生血管炎症反应[27]，进而诱导炎症细胞向该部位的迁移、募集以及局部脂质沉积，最终形成AS[28-30]。HIF-1作为缺氧诱导因子，其表达的增加可诱导人主动脉内皮细胞发生炎症及凋亡反应，从而促进AS发展[31]。与此同时，还有研究观察到Apelin对AS具有双向调节作用，不仅能通过促进血管平滑肌细胞增殖、单核细胞向血管内皮细胞黏附、血管新生、改变粥样斑块稳定性以促进AS的发展，也能通过减少内皮细胞ROS的产生，促进其消除、抑制内皮细胞衰老等作用抑制AS的进展[32,33]。分子对接结果显示，除花生四烯酸与IL6结合活性稍差外，其余对接结果均具有良好的结合活性，说明槲皮素与山奈酚很可能是治疗AS的关键成分。

本研究通过利用数据挖掘、生信分析等技术，发现蛭龙活血通瘀胶囊可通过L6、TNF、VEGFA、CCL2、MMP9、NOS3等靶点作用于AGE-RAGE、HIF-1、Apelin等多条信号通路，在抗炎、抗氧化、促进血管生成、抑制细胞凋亡等方面发挥抗AS的作用，具有多成分、多途径、多靶点的作用特点。但研究也存在不足，如可能遗漏部分生物利用度差但发挥良好作用的活性成分、对接成分偏少等，后期仍需进一步开展细胞、动物等实验进行验证。