基于生物信息学分析miR-125b-5p在肺腺癌中的表达及预后价值

郭 娜，徐 颖，李祥伶，王 鹏，李 琳，许 倩*，刘 镭*

（1.承德医学院免疫学教研室，河北承德 067000；2.承德医学院）

肺癌的发生率和死亡率均居世界前列[1]，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最主要的病理类型[2]。多数患者确诊时已处于中晚期，铂类化疗成为首选治疗手段[3]，但其耐药性常导致治疗失败或复发。

miRNA能够通过结合靶mRNA 3’-UTR区降解或抑制mRNA翻译，调节蛋白表达[4]，进而参与肿瘤发生发展的多个生物学过程，如增殖、侵袭、血管生成、耐药等[5,6]。有研究表明，miR-125b-5p在乳腺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）等肿瘤中表达异常[7-11]，且在顺铂耐药中也发挥作用，可能是逆转耐药的重要靶点[12-14]。但有关miR-125b-5p在LUAD耐药中的作用机制目前尚无报道。本研究通过生物信息学方法分析miR-125b-5p表达水平，预测其靶基因及预后价值，为进一步探索miR-125b-5p在LUAD中的作用机制及临床价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 生物信息学挖掘LUAD顺铂耐药相关miRNA

首先从GEO数据库中，以“lung adenocarcinoma”，“cisplatin”，“resistant”，“miRNA”为关键词，限定记录类型为“Series”，Organism选择“Homo sapiens”，筛选获得人类LUAD顺铂耐药相关数据集GSE56036[15]（顺铂敏感及耐药组织标本各9例）、GSE168707[16]（顺铂敏感及耐药组织标本各3例）、GSE43249（顺铂敏感细胞A549及耐药细胞A549/DDP标本各3例）和GSE157692[17]（顺铂敏感细胞A549及耐药细胞A549/DDP标本各2例）。运行R程序对上述芯片数据进行下载、标准化校正、探针注释，加载limma程序包进行基因差异表达分析。

1.2 miR-125b-5p的物种保守性分析

利用miRBase（http://www.mirbase.org）数据库检索miR-125b-5p在不同物种中的序列及注释信息，分析其保守性。

1.3 miR-125b-5p在LUAD组织中的表达分析

采用dbDEMC3.0数据库（https://www.biosino.org/dbDEMC/index）分析miR-125b-5p在人类肿瘤组织和正常组织中的差异表达情况。应用R程序下载TCGA数据库中LUAD及正常组织miRNA数据，分析miR-125b-5p表达差异情况。

1.4 miR-125b-5p的靶基因预测

通过TargetScan（http://www.targetscan.org），miRDB（http://www.mirdb.org）以及miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）3个miRNA靶基因数据库预测miR-125b-5p的靶基因，并应用在线venny工具（https://hiplot.com.cn/basic/venn），获得在3个预测网站上共同的靶基因用于后续分析。

1.5 miR-125b-5p靶基因功能富集分析

将miR-125b-5p的靶基因集合导入DAVID在线数据库（https://david.ncifcrf.gov/），进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析。GO分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个部分。

1.6 miR-125b-5p预后分析

应用R程序下载TCGA数据库中447例LUAD患者miRNA的表达数据和临床生存数据，根据miR-125b-5p表达水平的最优cut-off值将患者分为miR-125b-5p高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，通过logrank检验明确其与LUAD患者总体生存率的关系。

1.7 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技术验证miR-125b-5p表达水平

提取细胞总RNA，按照qRT-PCR定量试剂盒（上海吉玛）说明书进行操作。miR-125b-5p及内参U6的引物由吉玛公司设计，序列如下：miR-125b-5p上游引物5’-ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3’，下游引物5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3’；U6上游引物5’-CGCTTCGGCAGCCACATATAC-3’，下游引物5’-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3’。反应程序为：94℃，3min变性；94℃，12s；62℃，30s；72℃，30s；40个循环。相对表达量计算采用2－△△Ct法。实验重复3次。

1.8 统计学方法

使用软件SPSS 20.0进行统计学分析。采用两个独立样本t检验比较顺铂耐药与敏感组织（细胞）中基因的差异表达。采用log-rank检验评价Kaplan-Meier生存曲线的意义。多组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LUAD顺铂耐药相关miRNA

从GEO数据库4个芯片GSE56036、GSE168707、GSE43249和GSE157692中，分别获得41、20、145和301个差异表达的miRNA。结果进行可视化，火山图中红色代表上调基因，绿色代表下调基因（图1A～D）；热图展示了差异最显著的前20个基因（图1E～H）。4个芯片中显著差异基因（P＜0.05）取交集后获得miR-125b-5p（图1I）。

图1 差异基因的可视化

2.2 miR-125b-5p的物种保守性分析

m i R B a s e数据库查询结果显示，m i R-125b-5 p位于人染色体11 q 2 4.1区，其碱基序列为为5’-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3’；序列比对结果发现，miR-125b-5p序列在人、小家鼠、灰仓鼠、豚鼠、大鼠、家兔、猪、猕猴、马、蟾蜍等49个物种中完全一致，表明miR-125b-5p在物种间具有高度保守性。

2.3 miR-125b-5p在人类肿瘤及LUAD组织中的表达情况

dbDEMC3.0数据库分析miR-125b-5p在各肿瘤中的表达情况。结果显示，miR-125b-5p在淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤中表达上调，而在乳腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌等肿瘤中表达下调（图2A）；LUAD相关数据集提示，与正常肺组织相比，miR-125b-5p在LUAD组织中表达水平显著下调（图2B、C）。此外，TCGA数据库表达分析结果显示（图2D），与45例正常组织标本相比，miR-125b-5p在447例LUAD组织中显著下调（P=0.007）。

图2 miR-125b-5p在人类肿瘤和LUAD中的表达

2.4 miR-125b-5p靶基因预测

TargetScan、miRTarBase、miRDB 3个数据库预测出miR-125b-5p的靶基因分别有419、432、925个mRNA，3者取交集后靶基因有54个，如图3所示。

图3 TargetScan、miRDB和miTarBase数据库靶基因取交集

2.5 miR-125b-5p靶基因功能富集分析

GO分析结果表明，miR-125b-5p靶基因参与的BP包括调节基因表达、细胞大分子生物合成过程、基因表达等（图4A）；CC主要为核浆、转录因子复合物、顶端质膜等（图4B）；MF主要包括杂环化合物结合、有机环化合物结合、核酸结合等（图4C）。KEGG结果显示，miR-125b-5p靶基因显著富集于MicroRNAs in cancer、Protein processing in endoplasmic reticulum以及HIF-1 signaling pathway等通路（图4D）。

图4 miR-125b-5p靶基因GO和KEGG富集分析

2.6 miR-125b-5p与LUAD患者预后相关

根据miR-125b-5p在LUAD组织中表达水平计算得出cut off=87，据此将LUAD患者分为高表达组（118例）和低表达组（320例）。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，miR-125b-5p低表达组患者总生存期显著低于高表达组（图5），表明miR-125b-5p与预后显著相关，有望成为LUAD患者的预后标志物。

图5 miR-125b-5p在LUAD中的Kaplan-Meier生存曲线

2.7 miR-125b-5p在3株细胞系中表达水平比较

miR-125b-5p在16HBE、A549和A549/DDP细胞中的表达水平分别为（1.013±0.191）、（0.569±0.141）和（0.222±0.042），3株细胞系间存在显著差异（F=24.295，P=0.001）。与16HBE细胞相比，miR-125b-5p在A549细胞（P=0.008）和A549/DDP细胞中（P＜0.001）均显著下调；与亲本细胞相比，在耐药细胞A549/DDP中表达水平明显下降（P=0.023）。

3 讨论

化疗耐药是LUAD患者预后差、死亡率高的主要原因。本研究基于生物信息学获得在GEO数据库4个芯片中均差异表达的miR-125b-5p，提示其可能与顺铂耐药密切相关。同时，miR-125b-5p序列在多物种间具有高度保守性，说明其在物种进化及调控靶基因功能方面可能发挥关键作用。另外，泛癌组织表达分析显示，miR-125b-5p在淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤中表达上调，而在乳腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌等肿瘤中表达下调，提示miR-125b-5p既可作为癌基因，亦可充当抑癌基因，在不同肿瘤中发挥着不同的作用。有研究表明，miR-125b-5p在紫杉醇耐药肺癌细胞A549-PR和H460-PR中显著低表达，上调miR-125b-5p水平可能是一种逆转肺癌化疗耐药的新方法[18]。并且，有人预测发现，与A549细胞相比，miR-125b-5p在A549/DDP细胞中表达下调[19]，这与我们的qRT-PCR检测结果一致。上述结果都提示miR-125b-5p在LUAD耐药中可能发挥着重要的调控作用。

miRNA能通过抑制靶基因mRNA的表达来行使功能，且miRNA与mRNA的靶向作用是“多对多”的关系，即一个miRNA可调控多个靶mRNA，同时一个mRNA可受多个miRNA调控[20]。本研究通过3个数据库预测得到miR-125b-5p的54个靶基因，进一步的功能富集分析结果表明，靶基因主要富集在调节基因表达、细胞大分子生物合成过程、基因表达等生物过程；富集在核浆、转录因子复合物、顶端质膜等细胞组件；参与杂环化合物结合、有机环化合物结合、核酸结合等分子过程。并且KEGG结果显示，miR-125b-5p靶基因显著富集于MicroRNAs in cancer、Protein processing in endoplasmic reticulum以及HIF-1 signaling pathway等通路。其中，MicroRNAs in cancer和HIF-1 signaling pathway已被证实参与调控肿瘤耐药进程[21,22]。

miR-125b-5p在多种肿瘤组织中异常表达，与肿瘤患者预后密切相关，有望成为新的预后标志物。Hua等[8]研究发现，miR-125b-5p在肝癌组织中的表达水平显著低于配对癌旁组织，且miR-125b-5p低表达与肝癌患者的不良预后相关。同样，Yang等[14]检测miR-125b-5p在82对胆囊癌与癌旁正常组织的差异表达情况，结果显示，与正常组织相比，miR-125b-5p在胆囊癌组织中显著下调，并且其下调程度与胆囊癌预后不良相关，同时还发现miR-125b-5p是一种有效的化疗增敏剂，可作为胆囊癌患者新的预后生物标志物。此外，Zhang等[23]研究发现，NSCLC患者血清中外泌体miR-125b-5p水平较健康人显著下调，且与患者总体生存率下降密切相关，提示miR-125b-5p或可作为有应用前景的NSCLC预后生物标志物。本研究利用TCGA数据库中LUAD患者miRNA表达数据及相关临床生存数据，应用Kaplan-Meier分析了miR-125b-5p在LUAD中的预后价值。结果显示，miR-125b-5p低表达与患者预后不良相关，提示miR-125b-5p可能是评估LUAD患者预后的重要标志物。

综上所述，本研究从生物信息学角度分析了顺铂耐药相关的miR-125b-5p，发现其可能在LUAD发生发展过程中起到重要作用，为下一步开展相关研究提供了方向。但其具体的生物学功能仍需基础实验和临床大数据进一步验证。