芍药内酯苷通过抑制脊髓NLRP3炎症小体活化缓解神经病理性疼痛

徐 林，周剑宇

（承德医学院/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000）

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一种在全球范围内困扰人类健康的常见疾病[1,2]。NP的病因和机制非常复杂，目前尚未充分阐明，且缺乏有效的预防及治疗措施，迫切需要探索新的治疗靶点和特效药物[3]。NP多表现为神经免疫紊乱，而神经炎性反应在疼痛的发生和发展阶段扮演着重要角色。IL-1β是IL-1家族的成员之一，主要由活化的单核巨噬细胞产生，具有广泛的生物学效应，在免疫应答及炎症反应中起重要作用。在NP的发病机制中，IL-1β的作用至关重要[4,5]，而NLRP3炎症小体是合成成熟IL-1β重要途径[6,7]。芍药内酯苷为中药白芍的主要化学成分，具有广泛的药理活性。前期实验发现，芍药内酯苷具有对NP大鼠模型的镇痛作用，并初步探明其作用机制与通过抑制脊髓胶质细胞激活以降低IL-1β水平有关[8]。因此，推测芍药内酯苷镇痛作用与调控脊髓NLRP3炎症小体的活化有关。为证实该假说，本研究采用大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤模型（chronic constriction injury，CCI），观察芍药内酯苷对NP作用，并围绕脊髓NLRP3炎症小体探讨芍药内酯苷的作用机制。

1 材料和方法

1.1 药品

芍药内酯苷（购自成都麦德生科技有限公司），MCC950（NLRP3特异性抑制剂，购自MedChemExpress），异氟烷（购自深圳RWD生命科技有限公司）。

1.2 实验动物

40只雄性SD大鼠，体重180～220g（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2016-0006）。饲养于23±1°C环境下，光照周期12h。

1.3 实验仪器

Bioseb Von Frey电子测痛仪（法国Bioseb公司，BIOEVF4）；R58型小动物麻醉机（深圳RWD生命科技有限公司）；酶标仪（ThermoFisher，1510）；BME-410C热痛仪（中国医学科学院医学生物学研究所，BME-410C）；荧光显微镜（日本Olympus公司，Bx53）。

1.4 分组及给药方案

将40只雄性SD大鼠随机分为假手术（Sham）组，CCI模型组，CCI模型MCC950治疗组（CCI+MCC950），CCI模型AF治疗组（CCI+AF），每组10只。造模1d后开始，CCI+MCC950组、CCI+AF组每日腹腔注射相应药物溶液（MCC950 10mg/kg，AF 50mg/kg，均采用0.9%生理盐水稀释），连续给药至术后11d；Sham组与CCI模型组每日腹腔注射等量0.9%生理盐水。

1.5 CCI模型制备

参照Bennett的方法[9]，健康雄性SD大鼠通过小动物麻醉机持续吸入异氟烷麻醉，右后肢外侧备皮，75%酒精消毒，股骨外侧皮肤切开约1cm，钝性分离肌肉组织，用玻璃分针分离出坐骨神经，于坐骨神经大腿段中部结扎4道4.0号铬肠线，结扎力度以压迫神经不阻断血液供给为宜。结扎完成后，将坐骨神经归回原位，逐层缝合伤口。Sham组操作相同，但将坐骨神经分离后不予结扎，暴露适当时间后缝合伤口。术后将大鼠置于温暖环境待其苏醒，自由进水进食，术后每日观察大鼠状态。

1.6 机械性刺激缩足反射阈值（paw withdrawal threshold，PWT）

在温度适宜（23±1°C）的环境中，将大鼠置于透明有机玻璃箱中，使其适应环境至少30min。使用Von Frey电子测痛仪垂直于足底皮肤刺激大鼠右后肢足底，记录大鼠出现缩足反射时的显示数值，重复测量3次，每次间隔5min，计算3次测量平均值为PWT。各组大鼠均于术前1d，术后3d，7d，11d进行检测。

1.7 热痛缩足阈值（paw withdrawal latency，PWL）

采用BME-410C热痛仪检测大鼠PWL，在安静、温度适宜（23±1°C）的实验环境下，将大鼠放置于有机玻璃平面上，使其在检测环境适应一段时间。调整热痛仪光源和焦距，以适宜强度的光刺激大鼠右后足底部，记录大鼠出现缩足反射的时间作为PWL。实验中，以25s为光照时间上限，以防止大鼠烫伤。重复测量3次，每次间隔5min，计算3次测量的平均值作为PWL。各组大鼠均于术前1d，术后3d，7d，11d进行检测。

1.8 免疫荧光标记

于CCI术后第11d给药及行为学检测完成后处死大鼠，收集脊髓L4～L5段固定，石蜡包埋，组织切取厚度为5μm切片，切片脱蜡，使用柠檬酸修复缓冲液（pH 6.0）孵育，3%牛血清白蛋白（BSA）在25°C孵育30min，阻断非特异性蛋白。切片与兔抗NLRP3抗体（购自美国Novus公司）4°C孵育过夜。PBS（Ph 7.4）洗涤3次后，与连接有Cy3荧光染料的山羊抗兔抗体（购自Servicebio公司）孵育。孵育过后，切片用PBS清洗15min，置于载玻片上，用盖玻片覆盖。切片用荧光显微镜成像。

1.9 Caspase-1活性分析

CCI术后第11d，给药及行为学测试完成后，处死大鼠，收集脊髓腰椎L4～L5段，放入冷的裂解缓冲液中匀浆，以转速13000r/min离心15min后收集上清液。按照试剂盒说明，使用Caspase-1活性分析试剂盒（碧云天）检测海马中Caspase-1活性，使用酶标仪在405nm处进行吸光度测量。

1.10 酶联免疫吸附实验（ELISA）

CCI术后第11d给药及行为学测试完成后，处死大鼠，收集脊髓腰椎L4～L5段，加入冷的磷酸盐缓冲液（PBS）匀浆，13000r/min离心15min，取上清液。血清采用PBS稀释适宜倍数，混匀，采用ELISA试剂盒（R&D Systems公司，RLB00）检测IL-1β含量。在450nm波长条件下由酶标仪检测吸光度，根据标准品浓度与OD值建立标准曲线，计算IL-1β含量。

1.11 统计学分析

使用SPSS 26.0软件进行数据分析，所有计量数据采用均数±标准误（means±SE）表示。多组均数间的比较采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD检测法，若方差不齐采用Dunnett T3检验法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 机械痛阈与热痛阈检测

各组大鼠于术前机械性痛阈差异无统计学意义（P＞0.05）。与Sham组相比，CCI组大鼠在术后3d、7d、11d机械痛阈显著降低（P＜0.001），表明CCI手术诱发大鼠机械性痛觉超敏症状，成功建立NP模型。与CCI组相比，MCC950给药组大鼠机械痛阈在术后7d、11d显著提高（P＜0.01，P＜0.001）；与CCI组相比，AF给药组大鼠在术后11d机械性痛阈显著提高（P＜0.001），结果表明MCC950和AF均可有效缓解CCI大鼠机械性痛觉超敏（表1）。各组大鼠术前热痛阈差异无统计学意义（P＞0.05）。与Sham组相比，CCI组大鼠在术后各时间点热痛阈显著降低（P＜0.001），表明CCI手术成功建立NP模型。与CCI组相比，MCC950给药组大鼠热痛阈在术后3d、7d、11d出现显著提高（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01）；AF给药组在术后7d和11d热痛阈显著提升（P＜0.01，P＜0.01）。结果表明MCC950与芍药内酯苷均可有效提高神NP大鼠热痛阈（表2）。

2.2 脊髓中NLRP3炎症小体表达水平

术后11d收集大鼠脊髓腰椎L4～L5段组织，采用免疫荧光法对脊髓组织中NLRP3进行荧光标记，观察各组大鼠脊髓背角NLRP3表达情况。结果表明，与Sham组相比，CCI组大鼠脊髓背角NLRP3表达水平显著提高（P＜0.05），如附图A；与CCI组相比，CCI+MCC950组与CCI+AF组大鼠脊髓背角NLRP3表达水平显著降低（P＜0.01），如附图B。

附图 A.手术后第11d各组大鼠脊髓背角中NLRP3炎症小体免疫荧光染色；B.对脊髓背角中NLRP3的定量分析与Sham组比较，##P＜0.01；与CCI组比较，**P＜0.01

2.3 脊髓Caspase-1活性检测

术后11d处死大鼠后，取大鼠脊髓腰椎L4～L5段检测Caspase-1活性水平。与Sham组相比，CCI组大鼠脊髓Caspase-1活性显著提高（P＜0.001）。与CCI组相比，CCI+MCC950组、CCI+AF组大鼠脊髓Caspase-1活性水平均显著降低（P＜0.001）（表3）。

表3 各组大鼠脊髓Caspase-1相对活性水平

2.4 脊髓IL-1β含量测定

术后11d检测大鼠脊髓IL-1β含量，与Sham组相比，CCI组大鼠脊髓IL-1β含量显著提高（P＜0.01）；与CCI组相比，CCI+MCC950组、CCI+AF组大鼠脊髓IL-1β蛋白含量显著降低（P＜0.05）（表4）。

表4 各组大鼠脊髓IL-1β含量

NP多表现为神经免疫紊乱，神经炎性反应在疼痛的发生和发展阶段扮演着重要角色。炎症小体是近年来被人们发现的一类免疫蛋白复合物，其存在于胞质内，可感知机体内的外源性病原相关分子模式、内源性危险相关分子模式以及代谢相关分子模式的各种危险信号[10]。炎症小体包括以NBD为主体的支架蛋白、ASC接头蛋白和pro-caspase-l 3种主要结构[11]。炎症小体被激活后，各组成分子由接头蛋白ASC募集并聚合为蛋白复合小体，自身水解内部的pro-caspase-1使其成为成熟caspase-1，从小体中释放并利用其蛋白酶活性对IL-1β进行剪切，促进IL-1β成熟，进而在免疫炎症反应中发挥重要调节作用[12,13]。NLRP3炎症小体是中枢神经系统中最丰富的炎症小体，也是广泛神经系统疾病中引起神经炎症的关键因素之一[14]。有研究表明，通过特异性抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体的激活，可有效缓解痛觉过敏反应[15]。本实验结果显示，CCI大鼠手术侧脊髓背角NLPR3表达上调，大鼠机械痛阈、热痛阈显著降低，通过药理抑制NLRP3炎症小体的激活可以有效缓解痛觉敏化，说明NLPR3炎症小体参与了NP的发病过程，NLRP3炎症小体可能是治疗该病的潜在药物靶点。

在前期研究中我们发现，中药白芍的主要化学成分芍药内酯苷可以抑制NP状态下大鼠脊髓小胶质细胞的活化，并降低脊髓促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的水平，从而显著抑制脊髓背角的神经炎症反应，发挥对NP的镇痛作用[8]。本实验结果显示，芍药内酯苷显著下调了NP状态下大鼠脊髓NLRP3的表达，抑制caspase1的活性，并降低了脊髓IL-1β的水平，具有与NLRP3的特异性抑制剂MCC950相似的药理活性。该结果说明，芍药内酯苷可通过抑制脊髓NLRP3炎症小体的活化而对NP发挥镇痛作用。