基于GC-MS及网络药理学的肿痛洗剂作用机制研究

李胜群,李昕,陈璐晶,丰培学*，刘红兵*

(1.临沂市中医医院,山东 临沂 276000;2.中国海洋大学医药学院,山东 青岛 266003)

痔是最常见的肛肠外科疾病，在我国发病率占所有肛肠疾病的87.25%[1]，城市居民痔的发病率高达50.28%[2]，严重影响患者的身心健康和生活质量。手术治疗是《中国痔病诊疗指南(2020)》推荐的治疗方法之一，效果明确、成功率较高，但术后发生创面感染、水肿、疼痛的概率较高[3-5]。中药熏洗坐浴法能够直接对术后创面进行药物处理，发挥药力与热力作用，可消除水肿，缓解疼痛，利于患者康复，是值得临床推广应用的肛肠科术后治疗方法[3-6]。肿痛洗剂是临沂市中医院的医院制剂，由苍术、黄柏、薏苡仁、龙胆、大黄、炒桃仁、醋延胡索、花椒、白芍、炙甘草、防风等11味药组成，能清热燥湿、活血化瘀、消肿止痛，通过熏、洗、坐浴来治疗痔疮术后的疼痛、水肿、创面渗液等症，疗效颇佳，但药效物质及作用机制不清。本研究采用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析肿痛洗剂的挥发性成分，运用网络药理学方法探讨其消炎止痛的作用机制，以期为临床使用及质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Trace 1300/ISQ型GC-MS联用仪(美国 Thermo Fisher Scientific公司)；HGC-24A型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；AL204-IC型电子天平(瑞士梅特勒-托利多上海有限公司)。

1.2 材料 肿痛洗剂(批准文号：鲁药制字Z20160025；产品批号：20220118)，山东省临沂市中医院配制。乙醚为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备 量取10 mL肿痛洗剂，用等体积乙醚萃取，共3次；合并有机相，氮气吹干后，用2 mL乙醚溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，供GC-MS分析。

2.2 GC-MS条件 色谱条件：色谱柱为 Thermo TG-5MS(30 m × 0.25 mm,0.25 μm)。进样口温度250 ℃；炉温150 ℃；载气为氦气，流速为 1 mL·min-1，采用不分流模式；手动进样，进样体积 1 μL。程序升温：初温 70 ℃，保持1 min；然后以3 ℃·min-1速率升至 200 ℃，再以5 ℃·min-1速率升至 250 ℃，最后以 10 ℃·min-1速率升至300 ℃，保持2 min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度280 ℃，电离能为70 eV；质量扫描范围50～600 m/z，溶剂延迟时间5 min。

2.3 数据采集和分析 采用 Xcalibur 工作站对GC-MS原始数据进行校正，利用IXCR软件对色谱峰进行对齐和解卷积处理。采用NIST 11.0质谱数据库进行化合物检索(设置匹配度>800)；同时利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)以及台湾中医药数据库(http://tcm.cmu.edu.tw/index.php)，分别以苍术、黄柏、薏苡仁、龙胆、大黄、炒桃仁、醋延胡索、花椒、白芍、炙甘草和防风等为关键词检索其中的化学成分，综合鉴定肿痛冲剂中的挥发性成分。采用峰面积归一化法计算化合物相对质量分数。

2.4 成分靶点搜集 利用TCMSP和Pubchem数据库(https://pubch-em.ncbi.nlm.nih.gov/)，检索肿痛冲剂中挥发性成分(相对含量大于0.5%)的靶点，导入STRING数据库(http://STRING-db.org/cgi/input.pl，限制为Homo sapiens)进行格式转换；使用Pubchem数据库获得化合物smile号，导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测靶点。运用Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)进行靶点合并、去重和标准化。

2.5 消炎止痛相关靶点筛选 以疼痛(pain)和炎症(inflammation)为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中检索，以Gift≥30为筛选标准，筛选相关基因。

2.6 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，绘制化合物靶点与消炎止痛靶点的韦恩图；将所得交集靶点导入 STRING 数据库，限定物种为“Homo sapiens”，设置最小交互值(minimum required interaction score)为“highest confidence>0.4”，隐藏网络中无联系节点，构建PPI 网络图。节点(Node)代表靶点，边(Edge)代表它们之间的联系。将分析结果以 TSV 格式导入 Cytoscape 3.6.0 软件中，基于网络拓扑分析筛选度值(degree)大于平均数、介数中心性(betweenness centrality)和接近中心性(closeness centrality)均大于中位数的靶点，获得核心靶点蛋白。

2.7 核心靶点富集分析 利用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对核心靶点进行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析，以P<0.05，FDR<0.05作为筛选指标，表示差异具有统计学意义。

2.8 “成分-靶点-通路”网络构建 根据GC-MS鉴定的挥发性成分、消炎止痛核心靶点和代谢通路，使用 Cytoscape 3.6.0软件中merge功能，构建肿痛洗剂的“成分-靶点-通路”可视化网络图。节点(Node)代表成分、靶点以及通路，边(Edge)代表它们之间的联系。

3 结果

3.1 肿痛洗剂的挥发性成分 肿痛洗剂的GC-MS色谱图见图 1，化合物鉴定结果见表1。共鉴定出53个化合物，占总挥发性成分的82.54%，有62.33%的化合物确定了处方药味来源。

图1 肿痛洗剂挥发性成分的GC-MS总离子流图

表1 肿痛洗剂挥发性成分的GC-MS鉴定结果

3.2 肿痛洗剂主要挥发性成分的作用靶点及消炎止痛相关靶点 在肿痛冲剂的挥发性成分中，相对含量大于0.5%的化合物共计26个，涉及靶点502个；获得消炎止痛相关的靶点6 927个。绘制韦恩图(见图2)，得到MAOB、MAOB、ADH1B、ADH1C、ADH1A、LYZ等432个交集靶点，为肿痛洗剂消炎止痛的潜在靶点。

图2 肿痛洗剂主要挥发性成分与消炎止痛相关靶点的韦恩图

3.3 PPI网络构建 构建PPI 网络(见图3)，获得432个节点，7 743条边，平均节点度值为35.8，平均局部聚类系数为0.454；互作靶点与随机相似靶点组合对比具有显著差异(P<1.0×10-16)。基于网络拓扑分析，筛选得到127个核心靶点，degree由高到低依次为TNF、IL-6、INS、TP53、CTNNB1、IL-1β、VEGFA、MAPK3等(见图4)。

图3 PPI网络关系图

图4 基于PPI拓扑分析的核心靶点排序(degree排名前20)

3.4 靶点富集分析 对127个核心靶点蛋白进行GO分析，共富集到414个生物学过程、56个细胞组分、90个分子功能。结果提示，生物过程主要富集在基因表达正负调控、对药物的反应、正调控MAP激酶活性、细胞凋亡正负调控、应对缺氧的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等(见图5A)；细胞组分主要涉及细胞质、膜筏、胞浆核周区、质膜、细胞外间隙、胞外区等(见图5B)；分子功能主要富集在转录因子结合、蛋白结合、蛋白激酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、内肽酶活性、酶结合等(见图5C)。

图5 GO分析直方图(TOP10)

KEGG富集分析涉及163条信号通路，分析排名前30的通路(见图6)，发现与肿痛洗剂药理作用相关的有HIF-1、PI3K-Akt、IL-17 等3条关键信号通路。

图6 KEGG分析气泡图(TOP30)

3.5 构建“成分-核心靶点-通路”网络 使用 Cytoscape 3.6.0 软件，基于主要化合物、核心靶点、关键信号通路及其三者之间的连接度，构建肿痛洗剂“成分-靶点-通路”可视化网络图(见图7)。节点大小代表节点degree值大小，表示该成分与作用靶点的关联个数，degree值越大说明该成分越重要，共有156个节点，1 199条边。由图7可知，在26个主要化合物中，阿魏酸、大黄酚、邻苯二甲酸二丁酯、大黄素、(+)-匙叶桉油烯醇、棕榈酸、地奥酚、大黄素甲醚等8个化合物有较高的连接度；在127个核心靶点中，PTGS2、MAOB、ESR2、PPARG、PTPN1、EGFR、MAP2K1、IL-6、TNF等靶点的连接度高于其他靶点；3条关键信号通路缝隙连接的连接度基本相当，其中以PI3K-Akt 信号通路相对较高。以上结果提示，肿痛洗剂是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用达到发挥治疗作用。

图7 肿痛洗剂主要挥发性成分-消炎止痛核心靶点-关键信号通路图(蓝色代表肿痛洗剂主要挥发性成分，绿色代表核心靶点，黄色代表关键通路)

4 讨论

肿痛洗剂是院内制剂，用于痔疮手术术后常见的疼痛、创面水肿感染等症。该方由苍术、黄柏、薏苡仁、龙胆、大黄、炒桃仁、醋延胡索、花椒、白芍、炙甘草、防风等11味药组成，清热燥湿、活血化瘀、消肿止痛。本研究运用GC-MS法鉴定了53个挥发性化合物，其中花椒油素(xanthoxylin)相对含量最高。文献表明，花椒油素可抑制血小板凝聚，抑制药物引起的肠、子宫、膀胱等肌肉收缩，具有驱虫、杀菌、防霉、抗炎的功效[7]。通过构建“主要成分-靶点-通路”网络，发现阿魏酸、大黄酚、大黄素是肿痛洗剂重要的药效成分。阿魏酸源于黄柏，能抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂及抗血栓[8]；大黄酚和大黄素都是源于方中大黄的蒽醌类化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、保肝降脂、抗纤维化等作用[9]。

通过蛋白相互作用网络得到的关键核心靶点中，TNF可通过激活T细胞免疫活性参与免疫应答，具有杀伤转化细胞和某些病毒感染的细胞的能力[10]。IL-6具有促炎活性，在呼吸系统、循环系统及消化系统等炎症反应中起重要作用[11]。TP53通过调控miRNA的表达，诱导细胞分化和凋亡，调节细胞周期，参与炎症反应过程[12]；CTNNB1可以编码β-catenin，后者在自身免疫性疾病、炎症相关疾病中发挥重要的免疫调控作用[13]。PTGS2是构建的“成分-靶点-通路”网络中显著性最高的核心靶点，其在 IL-1β、TNF 等促炎因子刺激下产生前列腺素-2(PGE-2)，继而诱导局部白细胞聚集，加重炎症反应[14]。

通过富集KEGG通路分析可知，肿痛洗剂主要通过调控HIF-1、PI3K-Akt、IL-17 等信号通路等发挥治疗作用。HIF-1是干预炎症损伤、氧化应激、凋亡、肿瘤的重要信号通路[15]。PI3K-AKT通路可调节细胞分裂、分化、迁移等生理过程，具有促进细胞成活、抗炎及抗凋亡的作用[16]。IL-17 是一个重要的促炎症细胞因子，其信号通路与免疫调节相关，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用[17]。

综上，本研究运用GC-MS法鉴定了肿痛洗剂的挥发性成分，并利用网络药理学方法对其消炎止痛的药效成分、作用靶点及通路进行了预测和讨论，为其临床使用及质量控制提供参考。