基于生物信息学和分子对接技术研究当归六黄汤治疗溃疡性结肠炎潜在活性成分及分子机制

李静荣，梁冰宜，彭维，高永坚，林碧珊，曾杉，汤春花，陈锦霞，苏薇薇

(1.中山大学生命科学学院，广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275；2.国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528000)

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性、复发性结肠炎症性疾病，其特征是反复发作的腹痛、腹泻、血便、结肠运动功能障碍和永久性纤维化以及全身症状乃至癌变[2]。UC发病率在世界范围内呈上升趋势，预计到2025年，全球患病将高达3 000万人以上。UC发病机制尚不清楚，可能与遗传因素、超负荷的炎症、免疫和微生物环境暴露有关。

目前，有关UC的治疗主要有抗炎药物(如氨基水杨酸和糖皮质激素)、钙调神经磷酸酶抑制剂和生物药物(TNF-α抗体和α4β7整合素拮抗剂vedolizumab)等。但现有药物的有效性和安全性仍达不到要求，且生物制品多为静脉或皮下给药，无法维持治疗的持久性。因此，亟须进一步探讨UC的发病机制，为UC的治疗提供新的安全、有效、耐受的治疗药物。

当归六黄汤(DGLHD)源于金代名医李杲的《兰室秘藏》，由当归、地黄、熟地黄、黄芩、黄柏、黄连，黄芪等七味草药组成，功能主治“滋阴泻火，固表止汗”。现代药理表明DGLHD复方[7]或方中单味中药及其活性成分临床已经广泛用于治疗与炎症相关的疾病。例如，黄芩汤已经被广泛用于溃疡性结肠炎的治疗[8]。干地黄和熟地黄水煎液和提取物均可明显减少大鼠胃溃疡的发生率[9]。黄柏中的黄柏碱、巴马汀、小檗碱均呈现出很好的抗炎作用[10]。

虽然DGLHD复方或者其方中单味药材治疗UC已有较为丰富的临床经验，但其治疗UC的 “多成分”和“多靶点”的作用模式，尚未完全阐明。本研究采用网络药理学方法，通过高通量筛选、网络可视化和拓扑学分析，阐明药物、靶点和疾病之间复杂的网络关系，预测和分析中药化合物的多靶点作用机制，为DGLHD治疗UC提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 当归六黄汤(DGLHD)活性成分筛选 将“当归”“地黄”“黄芩”“黄芪”“黄柏”“黄连”输入中药系统药理学分析平台(TCMSP，https：//tcmspw.com)，检索当归六黄汤主要组成药材的全部化学成分。同时，采用口服生物利用度(OB)、Caco-2 细胞渗透率和类药性(DL)三项指标来评价所有成分的成药性。确定OB≥30%，类药性DL≥0.1，Caco-2 细胞渗透率≥0.4的预设标准，以筛选DGLHD中可能的生物活性成分进行后续的分析和研究。

1.2 药物-活性成分-靶点网络构建 通过TCMSP数据库寻找当归大黄汤的药物活性成分的相应蛋白靶点，并将靶点数据输入UniProt 数据库(https：//www.uniprot.org/)，选择物种为人，进行归一化和标准化命名，删除没有相应基因名称的目标蛋白。将获得的药物活性成分和对应靶点，通过Cytoscape 3.7.2 软件建立药物-活性成分-靶标关系图，并采用软件中的“Networkanalyze”功能进行网络拓扑分析，筛选出核心活性成分。

1.3 蛋白质相互作用(PPI)网络构建及拓扑分析 从DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)、Genecards数据库(https://www.genecards.org/)和DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)中检索与UC相关的基因。将获得的UC靶基因和当归大黄汤的活性成分的靶基因通过http://www.bioinformatics.com.cn(生物在线工具)进行Venn图映射交集处理，得到活性成分靶点-溃疡性结肠炎的交集靶基因。

通过在线String数据库，选择“Multiple proteins”选项，种属设置为“Homo sapiens”，置信度设为“0.9”，并选择隐藏散在的节点，获取交集靶基因的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络数据。将结果导入Cytoscape软件中进行可视化分析，通过 “cytohubba”插件，筛选Hub基因。用 “CytoNCA”插件进行拓扑学分析，分别以介数中心性(BC)、接近中心性(CC)、度中心性(degree)、特征向量中心性(EC)、局部平均连通度(LAC)、网络中心性(NC)等参数的中位值为筛选条件，确定核心靶点。

1.4 交集靶基因的GO功能注释和KEGG通路富集 通过Metascape在线数据库(https://metascape.org/)对交集靶点进行基因本体(GO)功能注释和KEGG通路富集分析。其中，GO富集分析用于通过三维维度来解释和注释基因，包括细胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)分析；而KEGG通路富集主要进行路径分析。分析物种为“Human(智人)”，至少包含3个基因，P值小于0.05以下具有统计学显著意义。结果保留q值(即校正后的P值)小于0.05的富集条目，并按照q值大小进行排序，输出柱状图。

1.5 “药物成分-核心靶点”分子对接验证 利用Discovery Studio 2016软件(中山大学药学院所购)对DGLHD关键活性成分与核心靶点的结合能力进行对接预测。DGLHD关键活性成分的Mol2格式文件和蛋白质的“PDB”格式分别从TCMSP平台和PDB 数据库(https：//www.rcsb.org/)下载。目标蛋白导入后，将目标蛋白的所有晶体水分子清除，采用软件中的“prepare protein”模块对蛋白受体进行去除原配体、水分子及添加氢原子等预处理并寻找活性口袋。对小分子配体进行能量最小化处理，并将小分子配体的所有柔性键设置为可旋转；应用软件中的CDOCKER功能对核心靶点蛋白受体和活性成分小分子配体进行分子对接，CDOCKER是基于格点和CHARMm力场的分子对接方法。以目标蛋白与配体之间的氢键、静电相互作用、π-π键或范德华力等各种键能来计算两者的结合能。结合能表示为负数(-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY)，数值越高表示结合能力越强，结合越稳定。受体蛋白和小分子之间相互作用以2D结构表示。

2 结果

2.1 当归六黄汤(DGLHD)活性成分的筛选和靶点识别结果 通过 TCMSP数据库共检索到395个化学成分，其中当归125个，熟地黄 76个，黄芩143个，黄芪87个，黄柏140个、黄连48个成分，未检索到生地黄的化学成分，但通过文献检索以及对当归六黄汤水煎液的高分辨质谱结果分析，获得7种生地黄化学成分。

根据预设标准进一步从中筛选得到82个潜在有效活性成分，其中当归4个，黄柏25个，黄连9个，黄芪15个(黄芪多糖和黄芪皂苷来源于文献报道黄芪的活性成分)，黄芩36个，熟地黄4个(见表1)，其中生地黄6个活性成分来自文献报道，并未按照预设标准进行筛选。

表1 当归六黄汤活性成分信息

2.2 当归六黄汤-活性成分-靶标网络的构建和分析 82个活性化合物最终输出407个对应的标准基因名，将结果导入Cytoscape 3.7.2软件，构建当归六黄汤-活性成分-靶基因网络。该网络有494个节点，包括7个药物节点，80个活性成分节点，407个靶基因节点，共1 870条边(见图1)。通过分析网络中活性成分节点和目标基因节点的度值和BC值，获得前10位活性成分，分别为β-谷甾醇、豆甾醇、油酸、小檗碱、巴马汀、腺苷、黄芩素、芒柄花黄素、7-O-methylisomucronulatol、地黄素A。

图1 “DGLHD-活性成分-靶基因”网络：网络中的方块代表DGLHD中的药物，多边形代表活性成分，菱形代表靶基因

2.3 PPI网络构建及核心靶点基因筛选结果 共筛选出UC疾病相关靶基因1 203个(至少存在于两个数据库中)，活性成分-溃疡性结肠炎的交集靶基因132个，这些基因被认为是当归六黄汤治疗UC的潜在作用靶点。

通过在线String网站构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)，如图2所示PPI 网络中共包含节点112个、522条边。利用 “cytoHubba”筛选出前6位的核心靶基因，分别为：STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、JUN、VEGFA。利用“CytoNCA”对PPI网络进行拓扑学分析和计算，得到BC、CC、degree、EC、LAC、NC等参数，第一轮筛选degree值>11(两次中位值)的基因，得到含有40个节点，254条边的网络图，第二轮筛选degree>21，BC>136，CC>0.415，EC>0.098，LAC>5.067，NC>6.33的基因，得到含有12个节点，45条边的网络，两次筛选后最终得到 12个核心靶点基因，同cytoHubba结果一致，同样包含STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、JUN、VEGFA等基因。

图2 交集靶基因PPI网络

2.4 GO功能注释和KEGG 通路富集分析的结果 对132个交集靶点的GO功能注释分析共得到2 484个条目(q值< 0.05)，包括生物过程2 209个、细胞组成100个、分子功能175个。其中生物过程主要涉及对炎症的反应、凋亡信号反应、细胞对化学应激、氧化应激的反应等；细胞组成涉及膜筏、细胞外基质、细胞质核周区等；分子功能主要集中于转录因子结合、血红素结合、蛋白激酶结合、受体调节活性等(见图3A)。

KEGG富集分析主要集中在“肿瘤通路”“糖尿病并发症中晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路”“内分泌抵抗”“NF-κB信号通路”“Th17细胞分化”等。KEGG信号通路气泡图如图3B所示。这些发现表明，炎症和免疫力的调节可能是DGLHD治疗UC的主要机制。

A.GO功能分析TOP10，BP-生物过程，CC-细胞组成，MF-分子功能；B.KEGG富集通路气泡图

2.5 当归六黄汤主要活性成分与核心靶点蛋白的分子对接结果 选择“2.2”项下结果中前10个活性分子(β-谷甾醇MOL000358、豆甾醇MOL000449、小檗碱MOL001454、油酸MOL000675、腺苷MOL001630、汉黄芩素MOL000173、芒柄花黄素MOL000392、7-O-methylisomucronulatol MOL000378、地黄素A MOL003731和黄芩素MOL002714)和“2.3”项下结果中前6个潜在核心靶基因(STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、JUN、VEGFA)进行分子对接验证，并通过Discovery Studio计算配体与受体的结合能。结果显示当归六黄汤活性成分与不同核心靶基因活性口袋中一个或多个氨基酸残基结合，形成氢键、π-π键或范德华力等，从而形成稳定的对接模式，各化合物与核心靶基因结合能见表2。我们选择结合能最低的构象(-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY得分最好)对接结果进行2D可视化展示(见图4)。

A.腺苷和AKT-1(4GV1)；B.腺苷和TP53(6VIP)；C.油酸和JUN(2G01)；D.腺苷和STAT3(1BG1)；E.腺苷和VEGFA(4ZFF)；F.腺苷和MAPK1(6G54)；氢键；盐桥；碳氢键；疏水键

表2 DGLHD活性化合物与核心靶基因结合能

3 讨论

本研究采用网络药理学和生物信息学结合方法，构建了DGLHD多成分-多靶点相互作用的可视化网络，分析DGLHD治疗UC的潜在有效活性成分、分子靶点和作用途径。通过对当归、地黄、熟地黄、黄芪、黄芩、黄连、黄柏化学成分的分析，确定了当归六黄汤中主要活性成分：β-谷甾醇、豆甾醇、油酸、小檗碱、巴马汀、腺苷、黄芩素、芒柄花黄素、7-O-methylisomucronulatol、地黄素A。分子对接结果也证明，他们与大多数核心靶基因可以形成很好的对接模式。

β-谷甾醇和豆甾醇是常见的植物甾醇，它们可以模拟哺乳动物体内的类固醇激素和植物生长激素，在UC治疗中的抗炎优势已被各种体内外实验证实。油酸(18∶1 n-9)，因为其抗癌、抗氧化等疗效被报道用于多种免疫及炎症疾病的治疗。临床试验结果表明，小檗碱(900 mg·d-1，连续3个月)显著降低了结肠组织中的Geboes分级。和mesalamine联合使用在中国人的溃疡性结肠炎中耐受性良好，并增强mesalamine在结肠组织中的抗炎作用。巴马汀，是当归六黄汤中另一种重要的生物碱，可以通过抑制色氨酸代谢和调节肠道微生物群来改善小鼠结肠炎。

黄芩素是黄芩中含量最高的化合物，进入血液后迅速转化为黄芩苷等代谢物，黄芩苷已被证实可显著抑制TLR4诱导的NF-κBp65激活，从而显著降低炎症因子的产生，并调节Th17/Treg细胞的平衡。黄芩素作用效果较黄芩苷略弱，这可能是因为黄芩苷的吸收慢，在体内的保留时间更长有关。腺苷可以调节肠道免疫系统，促进乙酸诱导的溃疡性结肠炎模型中结肠和直肠愈合。芒柄花黄素等系列异黄酮对PPARs表现出非常好的激活作用，而PPARG的激活可以抑制NF-κB通路的激活，从而在UC的治疗过程中发挥重要作用。因此，DGLHD中有效活性成分可通过抑制NF-κB和MAPK等炎症相关通路激活，进而抑制炎症因子的产生，同时调节肠道菌群，改善肠道脂类代谢，减缓溃疡性结肠炎的黏膜病变发挥协同作用。

对DGLHD和UC的 132个交集靶基因进行PPI分析，并确定了DGLHD治疗UC的6个核心靶基因，即VEGFA、MAPK、STAT3、AKT1、JUN、TP53。

血管生成是UC发病机制的重要组成部分，由炎症或者异常的免疫反应触发，影响疾病的进展和严重程度[22]。研究表明，VEGFA在溃疡性结肠炎患者的血清和组织中表达升高，介导炎症细胞的募集，增强招募以及单核细胞共刺激分子的表达。因此，能够靶向血管生成的分子有可能协同影响溃疡性结肠炎的疾病进程[22]。

对UC样本的微阵列数据集分析发现，MAPK可以作为UC诊断的生物标记物。大多数关于MAPKs对IBD的作用的研究进展主要集中在p38家族和JNK家族[25]。在UC肠道组织中，p38和JNK1/2的磷酸化水平显著增加。P38抑制剂SB203580可以通过抑制p38MAPK通路的激活，缓解溃疡性结肠炎的症状，并延缓病程进展。在DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型，JNK抑制剂SP600125可以使TNF-α、IL-6表达下调，并降低DAI、HI评分。Tofacitinib，一种泛jak抑制剂，在UC的2项Ⅲ期随机对照试验中，与安慰剂相比，对UC患者的临床、内镜和生活质量结果是有效的[27]。P53在未确诊癌症的严重慢性UC患者中存在高频突变，AKT1是PI3K-AKT信号通路的关键介质，参与促炎细胞因子的调控和释放。因此，上述核心靶点在UC发生和病程的发展中起着非常重要的作用，是DGLHD治疗UC的潜在靶点。

对靶基因GO/KEGG的富集分析表明，“肿瘤通路”、“糖尿病并发症中晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路”“肝炎B”“内分泌抵抗”“NF-κB信号通路”等可能是DGLHD治疗UC的潜在途径。以人群为基础的最新证据表明，UC患者发生结肠直肠癌的风险明显增加，在发病20年后约为7%[30]，在25年时的风险为7%～14%，在35年后高达30%。在IBD患者中发现了RAGE多态性和RAGE水平的升高，参与炎症与NF-κB的激活及其对氧化应激的反应相关[32]。促炎细胞因子、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6与胰岛素抵抗增加和糖耐量受损有关[33]。对980位IBD患者研究发现中国的IBD患者的HBV感染患病率高于欧洲、美国和中国的普通人群，特别是在年轻的克罗恩病患者中，应加强HBV疫苗接种和有针对性的覆盖率。在UC患者肠道中，肠道免疫平衡严重受损，效应免疫细胞过度激活，产生高水平的促炎细胞因子，导致结肠组织损伤。核转录因子κB(NF-κB)被确定为这种免疫环境中的关键调控因子之一。目前多种免疫抑制药物，如皮质激素和抗TNF-α抗体，均至少部分通过抑制NF-κB活性介导其抗炎作用。

分子对接结果显示，DGLHD的主要活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、油酸、小檗碱、巴马汀、腺苷、黄芩素、芒柄花黄素、7-O-methylisomucronulatol、地黄素对核心靶基因VEGFA、MAPK、STAT3、AKT1、JUN、TP53具有良好的亲和力。其中腺苷可与AKT-1、TP53、STAT3以及MAPK靶点的晶体蛋白通过氢键结合等分子作用力发生相互作用；而油酸、β-谷甾醇、豆甾醇以及芒柄花黄素等可以与JUN蛋白晶体和MAPK1蛋白晶体形成稳定的结合模式，提示DGLHD的关键活性成分主要通过干预炎症反应、氧化应激等关键信号靶点，在UC中发挥治疗作用。

综上所述，当归六黄汤在抗炎和免疫调节中发挥协同作用，通过“多成分、多靶点、多途径”的特点达到治疗溃疡性结肠炎的目的。