一种小鼠急性肝肾损伤病理模型的建立

相亦飞，纪 敏，吴莉芩，何家康

(广西大学 动物科学技术学院，南宁 530005)

随着我国饲料禁抗令的颁布实施，兽医临床在药物使用方面不断规范和标准化，但用量过大过久或不合理的联合用药等情况依然普遍，导致动物机体出现严重的急性肝肾损伤(acute liver and kidney injury)，不断危害着畜牧业的健康发展和食品安全，因此开发缓解肝肾损伤的药物意义重大。在筛选缓解肝肾损伤药物过程中，建立合理的肝肾损伤病理模型对于成功筛选药物尤其关键。通过查阅大量文献发现，顺铂(Cisplatin，CP)是临床上使用最广泛的化疗药物且药效与其给药剂量呈正比[1]，但用药后会有严重的不良反应，尤其是肝、肾、耳、神经毒性等是其临床应用的最大限制[2]。目前由CP诱导的急性肝肾损伤病理模型的实验动物种类和造模剂量并未规范和标准化。本试验旨在以不同浓度的CP诱导建立Balb/c小鼠急性肝肾损伤模型，探究不同浓度CP对肝脏和肾脏的影响，寻找符合动物福利要求的最适建模浓度，为研制缓解或预防急性肝肾损伤的新兽药提供简单、稳定、高效、可复制的病理模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Balb/c小鼠40只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(合格证：SCXK(湘)2016-0002)，雄性，体重20 g±2 g。模拟正常环境适应性饲喂1周后进行试验。

1.1.2 主要试剂 顺铂(CP)、二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma-Aldrich公司产品；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。

CP溶液配制：称取20 mg CP粉溶解于10 mL/L DMSO，用9 g/L NaCl配成终浓度为4 mg/mL，并将其倍比稀释为1 mg/mL 、2 mg/mL，配置好的溶液现配现用。

1.1.3 主要仪器 多功能酶标仪(Multimode PlateReader型)，瑞士TECAN公司产品；电子分析天平(AB104-L型)，瑞士梅特勒-托利多集团公司产品；台式高速冷冻离心机(TGL20MC型)，西安禾普生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性肝肾损伤病理模型的建立 将40只Balb/c小鼠随机分为健康对照组、CP(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)模型组4组，每组10只。禁食12 h后分组进行给药，按照每只小鼠0.2 mL的剂量腹腔注射(intraperitoned injection，i.p.)10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的CP诱导小鼠急性肝肾损伤，对照组则给予同样剂量的9 g/L NaCl。

1.2.2 小鼠体重变化与脏器系数 每天按时对小鼠体重、精神状况、皮毛光亮程度、饮水摄食以及排泄等情况进行记录。乙醚麻醉小鼠后，完整摘取肝、肾、脾脏，用9 g/L NaCl浸洗2次后滤纸干燥，称重、记录并计算，计算公式如下(单位：g)：

体重变化=最终体重-初始体重

脾系数=小鼠脾重量/体重×100%

肝系数=小鼠肝重量/体重×100%

肾系数=小鼠肾重量/体重×100%

1.2.3 小鼠肝肾功能的检测 72 h后，乙醚麻醉小鼠，眼球采血并收集于EP管中。4℃静置过夜，3 000 r/min离心10 min后小心收集上层血清，用于血清ALT、AST、BUN、CRE的检测。

1.2.4 组织病理学观察 40 g/L中性甲醛溶液固定摘取的肝肾组织48 h，按照流程制作病理切片后，在显微镜下观察其组间变化。

1.2.5 统计学分析 SPSS Statistics 23进行单因素方差分析法分析数据，采用Mean±SD表示。P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。与对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与CP(10 mg/kg)模型组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；与CP(20 mg/kg)模型组相比，Δ表示差异显著(P<0.05)，ΔΔ表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果

2.1 CP诱导的急性肝肾损伤小鼠的临床症状

试验开始前，各组小鼠均状态良好。腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的CP后，逐渐出现采食饮水减少、精神不佳、被毛粗乱甚至脱毛的情况，部分小鼠出现蜷缩埋头、食欲废绝、排尿较少甚至无尿，肛门周围污秽等现象。72 h后相比对照组，模型低剂量组(10 mg/kg)小鼠症状轻微，模型高剂量组(40 mg/kg)小鼠状态极差、濒临死亡，模型中剂量组(20 mg/kg)小鼠症状明显且不会影响生命。

2.2 CP对小鼠体重变化和脏器系数的影响

如表1所示，对照组小鼠体重随时间推移逐渐增加，而各模型组小鼠随计量增加体重显著下降(P<0.01)，各组肝脏系数并无明显差异。与对照组相比，各模型组随给药剂量的增加而肾系数显著增加(P<0.05)，以40 mg/kg组最为显著(P<0.01)。而脾系数相比对照组各浓度模型组小鼠的均极显著降低(P<0.01)。结果表明CP具有剂量依赖毒性，剂量越高对小鼠的损害越严重。

表1 小鼠体重和脏器系数的变化Table 1 Changes in body weight and organ coefficients of mice

2.3 CP对小鼠肝功能的影响

如表2所示，与对照组相比，模型中高剂量组(20 mg/kg、40 mg/kg)小鼠的血清ALT含量均极显著性升高(P<0.01)，各CP模型组小鼠的血清AST含量均极显著性升高(P<0.01)。结果表明，CP可剂量依赖性地升高小鼠血清中ALT和AST含量，对肝功能产生较大的影响。

表2 小鼠肝功能的检测Table 2 Detection of liver function in mice

2.4 CP对小鼠肾功能的影响

如表3，与对照组和模型低剂量组(10 mg/kg)相比，模型中、高剂量组(20 mg/kg、40 mg/kg)小鼠的血清BUN、CRE含量均极显著升高(P<0.01)。结果表明CP可剂量依赖性地升高小鼠血清BUN、CRE含量。

表3 小鼠肾功能的检测Table 3 Detection of kidney function in mice

2.5 CP诱导的小鼠急性肝肾损伤组织病理学观察

2.5.1 小鼠肝组织病理学观察 如图1所示(HE,×400)，对照组小鼠的肝组织未观察到组织病理学改变。相比对照组，模型低剂量组(10 mg/kg)小鼠的肝组织未发现明显异常，模型中高剂量组(20 mg/kg、40 mg/kg)小鼠的肝组织明显可见肝细胞空泡变性。

A.对照组；B.CP模型10 mg/kg组；C.CP模型20 mg/kg组；D.CP模型40 mg/kg组A.Control group；B.CP model 10 mg/kg group;C.CP model 20 mg/kg group;D.CP model 40 mg/kg group图1 肝脏病理切片(HE,×400)Fig.1 Liver pathological sections (HE,×400)

3.5.2 小鼠肾组织病理学观察 如图2所示(HE,×400)，对照组小鼠的肾组织未观察到组织病理学改变。与对照组相比，各剂量CP模型组小鼠的肾组织结构排列紊乱，模型低剂量组(10 mg/kg)小鼠的肾组织病理学改变较轻；模型高剂量组(40 mg/kg)小鼠的肾组织病理学改变最严重，肾组织近端小管表现出不同程度的退行性改变，如刷状缘消失、胞质空泡，肾上皮细胞脱落坏死等；模型中剂量组(20 mg/kg)小鼠的肾组织病理学改变显著，且不会快速致死。

A.空白组；B.CP模型10 mg/kg组；C.CP模型20 mg/kg组；D.CP模型40 mg/kg组A.Control group；B.CP model 10 mg/kg group;C.CP model 20 mg/kg group;D.CP model 40 mg/kg group图2 肾脏病理切片(HE,×400)Fig.2 Kidney pathological sections (HE,×400)

3 讨论

通过啮齿类动物构建病理模型是目前医学研究的热门首选之一，但对于急性肝肾损伤病理模型的试验动物种属和给药剂量尚未有明确的报道。大量研究表明CP诱导的小鼠急性肝肾损伤的给药剂量在5 mg/kg～40 mg/kg之间，剂量过小模型动物发病症状不明显，剂量过大容易致死，没有很好的遵循动物福利原则[3，4]。通过查阅大量文献最终选用Balb/c小鼠为建模动物，一次性单剂量腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的CP构建小鼠急性肝肾损伤病理模型，于72 h时采样观察以评价模型的成功与否。

试验发现，模拟临床使用CP治疗疾病时，模型小鼠的临床症状在剂量和时间上是具有依赖性的[5,6]。低剂量治疗时，小鼠出现贫血、体重减轻、活动量减少、采食饮水量减少等情况[7]；提高剂量治疗时，小鼠表现为典型的被毛凌乱、活动量减少、脱水、无食欲，随着时间的推移小鼠血清ALT、AST、BUN、CRE等肝肾生化指标明显升高，并出现脱毛、弓背、嗜睡、消瘦、出血性腹泻、体温降低。在4 d左右小鼠死亡，剖检可见胸腺萎缩，小肠内有出血现象[8]，通过组织病理学观察结果显示，肝肾组织出现较为明显的损伤[9]。CP给药可剂量依赖性地降低脾系数，增加肾系数，并升高小鼠血清BUN、CRE、ALT、AST含量[10-15]，小鼠在给药40 mg/kg的CP后，表现出严重的临床症状且濒临死亡。该试验结果表明，给药小鼠40 mg/kg时，可能发展成全身毒性，遭受严重痛苦，不适合后续的试验研究。

综上所述，CP诱导的小鼠急性肝肾损伤模型具有简单、可复制性、易于诱导、价格低廉等特点，且具有很高的临床相关性，一次性单剂量腹腔注射即可导致肝肾损伤。本试验选用Balb/c小鼠一次性单次腹腔注射不同剂量(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)的CP均可造成小鼠肝肾功能损伤，给予CP 10 mg/kg处理的小鼠肝肾损伤程度较轻，而经CP 40 mg/kg处理的小鼠肝肾组织严重损伤，小鼠濒临死亡。

综合小鼠临床症状及表现、血清肝肾功能指标水平以及肝肾组织病理学变化结果，遵循动物福利原则[16，17]，避免使用引起全身急性毒性的给药方案，本试验确定小鼠急性肝肾损伤模型方式为单次腹腔注射20 mg/kg的顺铂(CP)。