硫酸化朱砂七多糖对免疫应激鸡下丘脑与肾上腺c-fos表达及血清皮质醇含量的影响

张芮琪，卿素珠

(1.杨凌职业技术学院动物工程分院/动物疫病防控陕西省高校工程研究中心，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

免疫应激是指由外源免疫刺激引起的动物免疫激发，会影响动物的生长和生产性能[1]。免疫系统和神经内分泌系统密切联系、相互作用，形成了以下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴为最主要应激轴的神经-内分泌-免疫网络[2]。皮质醇是应激损伤的关键激素，其含量升高代表着HPA轴的激活；c-fos基因是编码核内蛋白的原癌基因，普遍存在于中枢神经系统，表达水平很低，难以检测，在受刺激的情况下可以迅速短暂地表达[3]。研究表明，c-fos基因在动物对外界的刺激中有重要作用[4]。

朱砂七[(Polygonumciliinerve(Nakai) Ohwl]为蓼科蓼属植物毛脉蓼的块根，属“太白七药”之一。其味苦、微涩，性凉，具有清热解毒、活血凉血、止血止泻、去风湿、强腰膝等功能[5]。朱砂七多糖(Polygonumciliinervepolysaccharides，PCP)是从朱砂七中提取出来的一种有效成分，在抗氧化、抗菌、抗病毒等方面具有重要的生物活性[6-7]。研究表明，PCP能显着降低猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)诱导的细胞凋亡率，对TGEV有较好的抑制作用[8]。另外，PCP可提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平[9]，减弱过氧化氢对RAW264.7细胞的损伤，增强细胞免疫力[10]。多糖硫酸化后可以使其原有的生物活性提高或出现新的药理活性，有研究显示某些多糖经硫酸化修饰后其免疫活性明显增强[11-13]。高硫代度的红芪多糖硫酸酯具有较好的体外抗凝血活性[14]。有关硫酸化朱砂七多糖在动物生产和免疫应激等方面的作用尚无资料报道，本试验以制备的朱砂七多糖和硫酸化朱砂七多糖(sulfatedPolygonumciliinervepolysaccharides，sPCP)为材料，通过雏鸡体内试验，用免疫组化方法检测各组雏鸡下丘脑及肾上腺组织c-fos表达水平、血清中皮质醇含量，研究硫酸化朱砂七多糖对新城疫疫苗免疫应激鸡下丘脑与肾上腺c-fos表达及血清皮质醇含量的影响，为中药多糖在抗动物免疫应激方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药多糖 朱砂七多糖由西北农林科技大学动物医学院中兽医实验室提供，纯度为72.2%。硫酸化朱砂七多糖参照文献[15]试验方法制备，采用氯化钡-明胶浊度法[16]测定硫酸化朱砂七多糖的硫酸基取代度为4.31。

1.1.2 疫苗和病毒 新城疫Ⅳ系(Newcastle disease virus La Sota strain Ⅳ,NDV-Ⅳ)灭活疫苗，购自瑞普(保定)生物药业有限公司。新城疫病毒由西北农林科技大学动物医学院禽病研究室提供，HA试验测得病毒效价为26。

1.1.3 试验用动物 1日龄非免疫健康海兰褐蛋公雏鸡60羽，购自杨凌惠凤蛋禽专业合作社。

1.1.4 主要试剂 免疫组化试剂盒及c-fos一抗，皮质醇ELISA试剂盒，柠檬酸钠抗原修复液，DAB显色试剂盒，Solarbio公司产品。

1.1.5 主要仪器 Motic数码显微镜，厦门Motic实业有限公司产品；GTK-2002自动恒温摊烤烘片机，西安瑞丰仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 雏鸡饲养管理与分组 雏鸡饲养至14日龄，随机均分为6组，除空白对照组外，其他各组分别用新城疫Ⅳ系疫苗进行点眼、滴鼻首免，28日龄二免。在首免同时，2个PCP组分别注射高(8 mg/mL)、低剂量(4 mg/mL)的PCP，2个sPCP对照组注射高(8 mg/mL)、低剂量(4 mg/mL)的sPCP，每只均为0.5 mL，对照组注射等量生理盐水，每天1次，连续3 d。

1.2.2 样品采集 分别于首免后第7天(D21)和二免后第7天(D35)每组随机抽取4只鸡经翼下静脉采血2 mL，收集血清。解剖鸡只，取各组鸡下丘脑和肾上腺组织以40 g/L多聚甲醛浸渍固定。

1.2.3 下丘脑和肾上腺石蜡切片制作 将固定好的各组鸡下丘脑和肾上腺修整后放入40 g/L多聚甲醛中固定，固定好的组织按常规组织学方法进行石蜡包埋、连续切片，切片厚度5 μm，水浴展片，黏附载玻片捞片，40℃烘干。

1.2.4 HE染色 烘干的切片脱蜡后，下行梯度乙醇溶液复水，按常规方法进行HE染色，切片脱水、透明，中性树胶封固。

1.2.5 c-fos免疫组化染色 切片脱蜡，PBS清洗；加入内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育20 min，PBS清洗；加入柠檬酸盐抗原修复缓冲液中微波修复10 min，PBS清洗；加入非免疫动物血清(羊)，室温下孵育20 min；加入c-fos抗体(1∶100)，室温下孵育1 h，PBS清洗；加入生物标记素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS清洗；加入LAP标记链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，37℃孵育30 min，PBS清洗；加入DAB显色液呈色，蒸馏水终止反应；肾上腺组织再以苏木精复染胞核，脱水、透明、封片。阴性对照以0.01 mol/L PBS液代替一抗，其余步骤同上。

1.2.7 结果观察与照相 显微镜下观察各组鸡下丘脑及肾上腺组织c-fos分布情况，Motic数码显微照相系统采集图片。

2 结果

2.1 PCP和sPCP对鸡下丘脑和肾上腺组织c-fos分布的影响

2.1.1 各组鸡下丘脑c-fos分布情况 经免疫组化染色的切片，背景无色或浅黄色，c-fos免疫反应产物呈棕黄色。

D21，对照组可见到数量较少的弱阳性神经元，其余各组雏鸡下丘脑均可见到不同程度的c-fos免疫阳性反应，反应产物主要出现于室旁核，以神经元胞核着色为主；D35，除对照组外，其余各组雏鸡下丘脑均可见到不同程度的c-fos免疫阳性反应(图1)。

A.对照组；B.疫苗组；C.高剂量PCP组；D.低剂量PCP组；E.高剂量sPCP组；F.低剂量sPCP组A.Control group;B.Vaccine group;C.PCP high -dose group;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group.图1 D35各组鸡下丘脑室旁核c-fos免疫阳性反应(×100)Fig.1 The positive reactions of C-fos in paraventricular nucleus of hypothalamus in 35-day chickens of six groups(×100)

A.对照组；B.疫苗组；C.高剂量PCP组；D.低剂量PCP组；E.高剂量sPCP组；F.低剂量sPCP组A.Control group;B.Vaccine group;C.PCP high -dose group;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group.*.与疫苗组相比差异显著(P<0.05)。*.Significant difference compared with vaccine group (P<0.05).图2 各组雏鸡下丘脑室旁核内c-fos阳性神经元数量Fig.2 The number of c-fos positive neuron in paraventricular nucleus of hypothalamus of chickens in six groups

2.1.2 PCP和sPCP对鸡肾上腺c-fos表达的影响 鸡的肾上腺包括被膜、皮质和髓质，皮质与髓质相混，界限不清。在实质的边缘、被膜下方可见到交感神经节。c-fos免疫组化染色结果显示，除了对照组外，各组鸡肾上腺皮质以及交感节均有不同程度c-fos免疫阳性反应(图3)。

A.对照组，呈c-fos阴性反应；B.疫苗组，皮质出现广泛的c-fos强阳性反应；C.高剂量PCP组，皮质有较强的c-fos阳性反应；D.低剂量PCP组；E.高剂量sPCP组；F.低剂量sPCP组；D、E、F可见皮质较弱的c-fos阳性反应。图A.×400，图B-图F.×100。A.The control group shows the negative reaction of c-fos;B.Vaccine group shows the wide range of strong positive reactions of c-fos;C.PCP high-dose group shows the stronger positive reaction of c-fos in adrenal cortex;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group;D-F.The weak positive reactions of c-fos were shown in Fig D，Fig E and Fig.F.FigA.×400；FigB-FigF.×100图3 PCP和sPCP对D35鸡肾上腺组织中c-fos表达的影响Fig.3 Effects of PCP and sPCP on c-fos distributions in chicken adrenal glands at 35-day

各组雏鸡肾上腺组织中c-fos阳性反应情况如表2所示。由表2可知，在D21和D35，与新城疫疫苗组相比，PCP组及sPCP组肾上腺皮质c-fos阳性反应程度均有所下降，以低剂量sPCP组效果最好，表明PCP和sPCP均有一定的抗应激作用，硫酸化修饰后PCP抗应激效果有所增强。

2.2 各组雏鸡血清中皮质醇含量变化

按照ELISA实验结果绘制标准曲线，得到线性回归方程式为：y=0.0219x+0.539(图4)。

图4 鸡血清皮质醇含量的标准曲线Fig.4 Standard curve of cortisol levels in chicken serum

按相应的回归方程，得出各组雏鸡血清中皮质醇含量如图5所示。由图可知，D21时，低剂量sPCP组和空白对照组皮质醇含量与疫苗组相比，均差异显著(P<0.05)，sPCP低剂量组及PCP组的血清皮质醇含量均低于疫苗组，但彼此之间差异不显著(P>0.05)；D35时，PCP组和sPCP组血清皮质醇含量均低于疫苗组，差异也不显著(P>0.05)。

A.对照组；B.疫苗组；C.高剂量PCP组；D.低剂量PCP组；E.高剂量sPCP组；F.低剂量sPCP组A.Control group;B.Vaccine group;C.PCP high -dose group;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group.*.与疫苗组相比差异显著(P<0.05)*.Significant difference compared with vaccine group (P<0.05).图5 各组鸡血清皮质醇含量Fig.5 Cortisol levels in chicken serum

3 讨论

应激发生时，首先作用于神经系统，激活HPA轴，改变相应脑区的内分泌机能。下丘脑为间脑前臂，可以接受末端信息、调节交感神经系统和神经内分泌功能，影响与应激有关的行为、神经内分泌免疫活动。大多数细胞中的c-fos基因表达量低，神经元细胞内c-fos基因在各种外源或内源性的刺激下，发生短暂迅速的高水平表达，将外界信号转变为基因表达，因其表达后的蛋白因子核内磷酸化蛋白(fos)生物活性有类似的第二信使的作用，所以又被称为第三信使。研究表明，存在空泡性损害的神经元中检测到c-fos蛋白的合成，c-fos蛋白表达的区域表明该部位存在不同程度的神经元损害[18]。本试验通过对各组雏鸡下丘脑室旁核内c-fos阳性神经元数量进行统计可知，下丘脑c-fos阳性神经元数量由高到低依次为疫苗组>高剂量PCP组>低剂量PCP组>高剂量sPCP组>低剂量sPCP组>对照组，说明给予PCP和sPCP可减少疫苗免疫雏鸡下丘脑室旁核c-fos阳性神经元的数目，其中低剂量sPCP组和疫苗组相比差异显著(P<0.05 )，说明低剂量的sPCP对疫苗应激引起的下丘脑c-fos表达有下调作用。肾上腺c-fos免疫组化染色结果显示，除了对照组外，各组鸡肾上腺皮质以及交感节均有不同程度c-fos免疫阳性反应；在D21和D35，与疫苗组相比，PCP组及sPCP组肾上腺皮质c-fos阳性反应程度均有所下降，以低剂量sPCP组效果最好，表明PCP和sPCP均有一定的抗应激作用，硫酸化修饰后PCP抗应激效果增强。

表1 PCP和sPCP对鸡肾上腺组织中c-fos表达的影响Table 1 Effects of PCP and sPCP on c-fos expressions in chicken adrenal glands

皮质醇是应激损伤的关键激素，它的含量升高代表着HPA轴的激活。此外，皮质醇的免疫抑制作用已广为接受，皮质醇可使淋巴细胞数量减少，使单核吞噬细胞功能降低。有研究表明血清皮质醇水平能在一定程度上代表慢性应激对机体的损伤程度[17]。糖皮质激素是HPA 轴的终末产物，因此常作为研究应激的最经典、最重要的指标之一。本试验结果显示，D21时，低剂量sPCP组和空白对照组皮质醇含量与疫苗组相比均差异显著(P<0.05)，sPCP低剂量组及PCP组的血清皮质醇含量均低于疫苗组，但差异不显著(P>0.05)；D35时，PCP组和sPCP组血清皮质醇含量均低于疫苗组，差异亦不显著(P>0.05)。结果表明PCP和sPCP具有一定的抗免疫应激作用，且以低剂量sPCP效果最好。