催产素受体在山羊颈中神经节的定位研究

陈文东，朱秀娟，何玉鹏，王 昱，徐永平

(1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃成县 742500；2.西北农林科技大学 动物医学学院，陕西杨凌 712100)

催产素(oxytocin,OT)是由9个氨基酸组成，在血液循环中以自由肽形式存在的神经内分泌激素，主要在下丘脑视上核、室旁核的大细胞中合成。其发挥的多种作用都是通过催产素受体(oxytocin receptor,OTR)介导的。OTR是一种由9个氨基酸组成的含有7个跨膜结构域的多肽,OTR与G蛋白藕联,激活磷脂酶C,通过细胞内的磷酸肌醇信号系统,诱导细胞质Ca2+浓度的增加,从而导致分娩时子宫强烈收缩[1-2]。OT广泛分布于黄体、卵巢、羊膜、绒毛、胎盘、蜕膜、睾丸、胸腺、肾上腺和胰腺等器官，通过与各部位的OTR结合发挥作用。其中在心脏、黄体、睾丸、胸腺还可以局部合成。此外，OT在脑内亦有广泛的受体结合位点，如下丘脑、海马、杏仁核、纹状体、伏隔核(nacc)、终纹床核(bnst)、脑干，参与痛觉调控、性行为、学习、社会交往、记忆等高级神经活动[3]。

颈中神经节 (middle cervical ganglion,MCG) 是交感节后神经元的聚合体，其发出分支主要支配心脏及附近大血管[4]。有研究表明，OT被当作一种心血管激素，可调节血管张力和控制心脏功能发挥内分泌调节作用，OT亦可在大血管和心脏处合成释放，与心脏上的OTR结合发挥降低心率和收缩力的旁分泌作用[5]。OT作为下丘脑—垂体—性腺轴上一种重要的激素，除了可以发挥内分泌和自分泌作用外，是否可以通过外周神经通路对心血管系统发挥调节作用，以及OT对心血管的激素调节和经颈中神经节的交感节后纤维对心血管的神经调节这两种调节方式之间是否存在联系，缺乏相关的研究资料。本试验采用免疫组织化学SP法，检测山羊颈中神经节内OTR的表达分布特点，为探索山羊颈中神经节是否具有成为OT对内脏器官进行内分泌调节和通过自主神经对内脏器官进行神经调节两者相互协调作用节点的条件提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 杨凌农户养殖的成年关中奶山羊，雌雄各5只，临床健康，雌性未孕。全部试验在西北农林科技大学动物医学院神经生物学实验室完成。

1.1.2 主要试剂 免疫组化SP超敏试剂盒(货号KIT-9706)和内源性生物素阻断试剂盒(货号BLK-0001)，福州迈新生物技术开发有限公司产品；兔抗OTR多克隆抗体(货号BA23081)，北京康为世纪生物科技有限公司产品；四盐酸3,3-二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(货号M1417-1)，北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机(RM2235)，德国Leica公司产品；生物显微镜(BA310)，Motic实业集团有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 切片染色 将健康非妊娠成年山羊颈总动脉放血处死，迅速取出其颈中神经节，置于40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液中固定12 h，自来水冲洗12 h，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，包埋，石蜡切片机7 μm连续切片。切片分4套，第1套做HE染色，用于观察神经节的形态结构。第2套做免疫组织化学染色用于图像分析，切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，然后进行抗原修复，SP试剂盒A、B、C、D液分别孵育20 min，并在B液之后用1∶250稀释的兔抗OTR多克隆抗体孵育，空白对照用PBS代替，4℃下过夜，最后DAB显色5 min、梯度酒精脱水、中性树胶封片。第3套做空白对照，并用苏木素复染，用于检测非特异性染色。第4套在DAB显色后用苏木素复染，用于定位观察神经节内各阳性结构。

2 结果与分析

2.1 颈中神经节的光镜结构特点

山羊颈中神经节表面包裹一层结缔组织被膜，其与神经节内结缔组织相连。山羊颈中神经节中神经元多成群分布。由图1可见，颈中神经节中可见神经细胞成群分布，相对于其他细胞，神经细胞(图1-A)体积较大，胞体结构各异，各神经细胞之间及神经细胞与周围组织之间边界清晰，结构完整，还可见部分无核神经细胞。颈中神经节内神经细胞大小不等，最大神经细胞直径达47.87 μm，最小直径为19.95 μm(测量有核神经细胞，Image-pro plus 6.0测量)。神经细胞胞质(图1-C)着色为紫红色；胞核(图1-B)呈圆形或卵圆形，在神经细胞的边缘或正中央位置，着色为蓝色，少部分胞核内可见核仁结构，染色较核质颜色更深。神经细胞周边有支持细胞(图1-G)环绕，其形态扁平状，结构清晰。在众多神经细胞之间有神经纤维(图1-D)和微血管(图1-E)通过，神经纤维上包裹有雪旺细胞(图1-H)，胞核呈长卵圆状；微血管内壁上的血管内皮细胞(图1-F)清晰可见，微血管管腔内可见有少量血细胞存在，着色为红色。

Ⅰ.山羊颈中神经节HE染色。Ⅱ.山羊颈中神经节HE染色。A.神经细胞；B.细胞核；C.细胞质；D.过路纤维；E.微血管；F.血管内皮细胞；G.支持细胞；H.雪旺细胞Ⅰ.HE staining of the middle cervical ganglion in goat;Ⅱ.HE staining of the middle cervical ganglion in goat.A.Nerve cells;B.Nuclei;C.Cytoplasm;D.Passing nerve fibers;E.Microvassel;F.Vascular endothelial cells;G.Sertoli cells;H.Schwan cells图1 山羊颈中神经节的微细结构(400×)Fig.1 Microscopic structure of middle cervical ganglion of goats (400×)

2.2 OTR的免疫组织化学染色

对照组切片复染结果(图2-1)可见，神经细胞胞体着色为浅紫色，神经细胞胞核着色为深紫色，整个切片背景浅蓝色，没有其他着色。切片复染结果(图2-2)可见，神经细胞胞体着色为棕褐色或黄褐色，其他非神经细胞结构胞核着色为紫色，证明本试验免疫组化SP染色结果没有非特异性着色。免疫组织化学染色结果(图2-3、图2-4)可见，颈中神经节各种细胞着色深浅不一，根据着色深浅将OTR表达分为4个等级，棕褐色为强阳性，黄褐色为中等阳性，淡黄色为弱阳性，无着色或浅黄色为阴性反应。试验组免疫组化SP染色结果显可见，OTR在雌雄山羊颈中神经节内的分布未见明显差异，山羊颈中神经节内OTR免疫阳性产物分布广泛，神经细胞、过路神经纤维、血管内皮细胞、支持细胞和雪旺细胞均有不同程度的着色。OTR免疫阳性产物在神经细胞的胞质(图2-C)和细胞核核膜(图2-B)着色最深，为棕褐色，呈强阳性。大部分神经细胞胞质着色为黄褐色，呈中等阳性，这部分神经细胞胞质约占神经细胞总数的91%。血管内皮细胞(图2-F)、细胞膜，以及一小部分神经细胞胞质和少量神经纤维(图2-D)着色较浅，为淡黄色，呈弱阳性。大部分的过路神经纤维着色极浅或不着色，为阴性。

2.3 颈中神经节中OTR的相对表达量

图像分析结果表明，颈中神经节中神经细胞内的OTR相对表达量极显著大于非神经细胞结构(P<0.01，表1)。

表1 颈中神经节中OTR的表达量分析Table 1 The expression of OTR in the middle cervical ganglion

3 讨论

动物体内OT与OTR特异性结合是其发挥生物学功能的必要条件之一[6]。OTR存在于小鼠体内乳腺、肾脏和子宫等器官，尤其在肾小管、子宫基质细胞和乳腺上皮细胞中含量最高[7]。研究表明，OT基因敲除小鼠在繁殖、交配、新生鼠大小、怀孕和性行为等方面与正常小鼠无显著差异，但基因敲除小鼠的新生后代会在24 h内全部死亡，此种现象与基因敲除小鼠乳汁分泌和母性缺失有关，除此之外，基因敲除小鼠还出现明显的肥胖、体温升高、攻击行为、社交记忆和社交情感降低现象[8-9]。以上资料表明，OT具有调控雌性动物泌乳、生殖、能量代谢、社交和母性行为的功能，且这些功能的行使都是通过OTR激活来完成的。伞明君[10]利用OTR基因过表达小鼠模型研究发现，OTR可诱导小鼠排卵异常、卵巢多囊症、基础代谢率升高和体重减轻。Kodama Y等[11]发现，在恶性间皮瘤组织中有大量的OTR表达，OTR基因敲除试验可显著降低高表达OTR的恶性间皮瘤细胞增殖，口服OTR拮抗剂可明显抑制恶性间皮瘤的进展，表明OTR在恶性间皮瘤细胞增殖中起着至关重要的作用，是一个非常有希望的潜在治疗靶点，并可能成为恶性间皮瘤的预后生物标记物，黄双[12]等利用免疫组织化学SP法发现OTR在山羊颈动脉体内广泛分布，以此推断OT可能以分泌方式调节颈动脉体的血流量。OTR在小鼠海马CA2和CA3区、整个皮质和皮质杏仁核、嗅前区、弓状下丘脑核和背侧内膜状核表达[6]。在哺乳动物大脑经典奖赏通路内(多巴胺奖赏通路)广泛分布[13]，如腹侧被盖区、腹侧纹状体和伏隔核等核心节点[14]，OTR分布于海马、前扣带回皮层和杏仁核等位置发挥记忆、学习和亲社会学习等功能[15-16]。

动物机体内脏生理活动受植物性神经系统和内分泌系统共同调控。颈中神经节属于植物性神经系统交感节后神经元，位于动物迷走交感干中段，锁骨下动脉前方，呈椭圆形，灰褐色[17]，其发出节后纤维支配胸腔内心脏和附近大血管。而有研究发现OTR可在动物机体心脏和大血管处介导OT的旁分泌作用，有关OTR在外周神经系统分布的报道中，任妮[18-19]、陈文东[20]等采用免疫组织化学SP法分别在山羊颈胸神经节、肠系膜前神经节、颈前神经节和肠系膜后神经节发现有OTR表达，推断OT可能会作用于交感节后神经元，通过交感节后纤维对其所支配的内脏器官发挥调节作用。本研究通过免疫组织化学试验技术证实，OTR免疫阳性产物在山羊颈中神经节内广泛表达分布，且颈中经节神经细胞内的OTR阳性产物表达量极显著大于其他非神经细胞结构(P<0.01)。OTR主要表达分布在山羊颈中神经节交感节后神经细胞内，提示OT发挥作用的主要靶细胞为山羊颈中神经节中的交感节后神经细胞，表明山羊颈中神经节具有OT对内脏器官进行内分泌调节和通过自主神经对内脏器官进行神经调节两者相互协调作用节点的条件，但催产素通过植物性神经对心血管活动产生什么样的影响，还有待进一步研究。